Новый тип высокоэффективных иммобилизованных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантовНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2008 г.-31 декабря 2008 г. Новый тип высокоэффективных иммобилизованных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантов
Результаты этапа: клеток микроорганизмов, предназначенных для обнаружения и обезвреживания широкого спектра фосфорорганических токсикантов, представляющих собой как собственно такие вещества, так и первичные, а также вторичные продукты их разложения. Разработан новый иммобилизованный биокатализатор на основе штамма Aspergillus niger F-679, выбранного в результате скрининга среди мицелиальных грибов родов Aspergillus, Fusarium, Mucor, Penicillium, Trichoderma. Биокатализатор способен разлагать продукты деструкции пестицида хлорпирифоса (3,5,6-трихлоро-2 пиридинола и О,О’-диэтилтиофосфата), имеющего широкое применение в народном хозяйстве. Скорость разложения 3,5,6-трихлоро-2 пиридинола под действием биокатализатора (750 мкг/л/ч) превышает известный параметр для свободных клеток в 60 раз. Установлены основные каталитические характеристики этого иммобилизованного биокатализатора, а также оптимальные условия его получения и использования в процессе деструкции продуктов ферментативного гидролиза фосфорорганического пестицида хлорпирифоса. Разработаны иммобилизованные биокатализаторы на основе бактериальных клеток Pseudomonas sp. и E. coli, содержащих фермент органофосфатгидролазу с шестью остатками гистидина (His6-OPH). Показана высокая эффективность их применения для разложения фосфорорганических токсикантов, а также продуктов их деструкции (на примере пестицидов Параоксона, Паратиона и Кумафоса и отравляющих веществ, в частности, изобутилового эфира метилфосфоновой кислоты и самой метилфосфоновой кислоты, являющихся продуктами ферментативного гидролиза вещества типа Vx).Выявлены основные физико-химические и каталитические характеристики этих иммобилизованных биокатализаторов и подобраны оптимальные условия их использования (температура, рН, состав среды, концентрации токсикантов). Впервые показана возможность разложения фосфорорганических токсикантов под действием разработанных иммобилизованных биокатализаторов не только в виде чистых веществ, но и в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения отравляющих веществ, после их предобработки ферментативными препаратами, также полученными в рамках данного проекта. Разработана схема синтеза и оптимизирована методика получения сверхмакропористого носителя на основе криогеля сшитого сополимера N.N-диметилакриламида, аллилглицидилового эфира и N,N’-метилен-бис-акриламида для дальнейшего введения на носитель иминодиацетатных группировок, их хелатирования ионами переходных металлов и последующей координационной иммобилизации фермента. Изучены структуры формирующихся криогелей, показана эффективность их использования для иммобилизации белков (на примере органофосфатгидролазы, модифицированной полигистидиновыми последовательностями разной длины) с целью получения высоко эффективных биокатализаторов, способных длительно функционировать в проточных системах. Получены прототипы иммобилизованных ферментных биокатализаторов для проточных систем на основе органофосфатгидролазы, содержащей полигистидиновые последовательности разной длины, и гибридного белка, содержащего в качестве молекулярных партнеров органофосфатгидролазу и зеленый флуоресцентный белок с обратимо изменяющейся рН-чувствительной флуоресценцией. Исследовано влияние химического состава иммобилизованных биокатализаторов (тип фермента, белковый состав ферментного препарата, используемого для иммобилизации, металл, используемый для зарядки носителя и др.) на их каталитические характеристики. Установлено влияние различных факторов (рН и температура реакционной среды, длительность проведения процесса, скорость протока, белковый состав иммобилизованного ферментного препарата) на свойства полученных иммобилизованных ферментных биокатализаторов. Выявлены факторы, влияющие на стабильность каталитических характеристик ферментативных биокатализаторов при их функциональном тестировании и длительном хранении в различных условиях. Показана возможность получения сухих форм иммобилизованных ферментных препаратов на основе разработанных носителей, установлена возможность их регенерации (до 20 раз) и продолжительного использования в проточных системах. Определены основные каталитические свойства полученных иммобилизованных биокатализаторов на основе гибридных белков с активностью органофосфатгидролазы и флуоресценцией зеленого флуоресцентного белка, предназначенных для гидролиза фосфорорганических токсикантов и контроля этого процесса по уровню флуоресценции, выявлено влияние на эти свойства различных факторов (рН, температура, длительность эксплуатации, состав самого белка, в частности, спейсеров, соединяющих белковых «партнеров» по гибридному белку и др.). Разработаны подходы к созданию новых иммобилизованных биокатализаторов на основе гибридных форм органофосфатгидролазы, имеющей молекулярного партнера в виде рН-чувствительного зеленого флуоресцентного белка, способного обеспечить детекцию присутствия фосфорорганических соединений на различных твердых поверхностях в случае контакта биокатализатора и исследуемого объекта. Созданы образцы тканевых биокатализаторов с использованием ковалентного способа иммобилизации белка, установлена зависимость свойств биокатализатора от концентрации вводимого белка, условий проведения иммобилизации – длительность экспозиции, молекулярной массы полимера в составе носителя, концентрации сшивающего агента. Показана высокая стабильность полученных препаратов при их хранении во влажном состоянии в присутствии и отсутствие различных антимикробных агентов.
2 1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. овый тип высокоэффективных иммобилизованных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантов
Результаты этапа: Целью проекта было создание научных основ технологии получения и применения новых высокоэффективных иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов и клеток микроорганизмов, предназначенных для обнаружения и обезвреживания широкого спектра фосфорорганических токсикантов, представляющих собой как собственно такие вещества, так и первичные, а также вторичные продукты их разложения. Разработан новый иммобилизованный биокатализатор на основе штамма Aspergillus niger F-679, выбранного в результате скрининга среди мицелиальных грибов родов Aspergillus, Fusarium, Mucor, Penicillium, Trichoderma как эффективный деструктор продуктов деградации пестицида Хлорпирифоса, Кумафоса и Диазинона, имеющих широкое практическое применение. Разработаны иммобилизованные биокатализаторы на основе бактериальных клеток Pseudomonas sp. и E. coli, содержащих фермент органофосфатгидролазу с шестью остатками гистидина (His6-OPH). Показана высокая эффективность их применения для разложения фосфорорганических токсикантов, а также продуктов их деструкции (на примере пестицидов Параоксона, Паратиона и Кумафоса и отравляющих веществ, в частности, диизобутилового и изобутилового эфиров метилфосфоновой кислоты и самой метилфосфоновой кислоты, являющихся продуктами ферментативного гидролиза вещества типа Vx). Разработана схема синтеза и оптимизирована методика получения сверхмакропористого носителя на основе криогеля сшитого сополимера N.N-диметилакриламида, аллилглицидилового эфира и N,N’-метилен-бис-акриламида для дальнейшего введения на носитель иминодиацетатных группировок, их хелатирования ионами переходных металлов и последующей координационной иммобилизации фермента. Изучены структуры формирующихся криогелей, показана эффективность их использования для иммобилизации His6-OPH с целью получения высоко активных биокатализаторов, способных длительно функционировать в проточных системах. Получены новые гибридные белки, содержащие в качестве молекулярных партнеров ОРН и зеленый флуоресцентный белок с обратимо изменяющейся рН-чувствительной флуоресценцией. Разработаны подходы к созданию новых иммобилизованных биокатализаторов на основе полученных гибридных белков, способных обеспечить детекцию присутствия фосфорорганических соединений на различных твердых поверхностях в случае контакта биокатализатора и исследуемого объекта. Созданы образцы тканевых биокатализаторов с использованием ковалентного способа иммобилизации белка. Разработаны теоретические основы стратегии применения разработанных иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов и клеток различных микроорганизмов (бактерий и мицелиальных грибов) для комплексной биодеструкции фосфорорганических токсикантов и продуктов их разложения, присутствующих в составе существующих сложных многосубстратных систем (на примере широко применяемых пестицидов (кумафоса, диазинона) и реакционных масс, получаемых после уничтожения отравляющих веществ (вещества типа Vx). Впервые был исследован и предложен механизм ферментативного разложения соединений, содержащих С-Р-связь, при участии фермента His6-OPH. Впервые установлена возможность использования этого фермента для разложения С-Р связи как в свободной, так и иммобилизованной форме. Создана кинетическая модель, описывающая функционирование фермента в такой сложной многосубстратной системе, как реакционные массы, получаемые после химического уничтожения отравляющего вещества типа Vx. Показаны различные варианты реутилизации разработанных микробных биокатализаторов. Установлено, что в средах, содержащих различные продукты ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений, не происходит изменения прочностных характеристик гранул биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов даже после их длительного использования в процессах деструкции целевых субстратов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".