Структура, функция и регуляция активности теломеразы.НИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 марта 2014 г.-15 декабря 2014 г. Структура, функция и регуляция активности теломеразы.
Результаты этапа: Проект направлен на понимание фундаментальных механизмов работы теломеразы и регуляции этого фермента. В модельном организме - термотолерантных дрожжах Hansenula polymorpha показано существование альтернативного общеизвестным механизма такого этапа процессинга теломеразной РНК (TER) как стабилизация 3’-конца РНК. Показано, что, в отличие от других видов дрожжей, этот процесс у H. polymorpha не задействует Sm-белки. Проведенный поиск новых белков, которые могут связываться с 3’-концевой областью TER на основе in vitro системы, моделирующей 3’-конец теломеразной РНК термотолерантных дрожжей дополнительно слитый с последовательностью ТТ7-РНК шпильки для выделения взаимодействующих белков, не выявил новых кандидатов для осуществления такой стабилизации, что требует модификации выбранной системы in vitro или независимого подтверждения отсутствия такого белка. Исследовано взаимодействие Est3 и N-домена HpTERT для термотолерантных дрожжей двумя способами и показана его специфичность.
2 1 марта 2015 г.-15 декабря 2015 г. Структура, функция и регуляция активности теломеразы.
Результаты этапа: Цели проекта за отчетный год выполнены полностью. Одной из целей была проверка предположения, что hpEst3 один способен выполнять функцию фактора процессивной работы теломеразы. Отсутствие удлинения теломер, возникающее при повышенной процессивной работе теломеразы, при суперэкспрессии гена белка hpEst3 в клетках термотолерантных дрожжей позволяет говорить о том, что этот белок не является фактором процессивной работы теломеразы или для этой функции ему необходимы какие-либо партнеры в стехиометрическом количестве. Другой целью было определение необходимости N-конца белка для функционирования этого белка. Было показано, что белок hpEst3 без 12 дополнительных аминокислот на N-конце препятствует поддержанию длины теломер в термотолерантных дрожжах. Разработана система на основе биотин содержащего модельного транскрипта теломеразной РНК для поиска белка, взаимодействующего с 3'-теломеразной РНК в H.polymorpha.
3 1 марта 2016 г.-31 декабря 2016 г. Структура, функция и регуляция активности теломеразы.
Результаты этапа: Цели проекта за отчетный год выполнены полностью. Планировалось проверить возможное участие белка EF-1A в стабилизации 3'-конца теломеразной РНК H. polymorpha. Был создан штамм с белком EF-1A, содержащим НА-таг на С-конце, используя подход применённый при создании штамма Smb1-HA. Провели иммунное осаждение EF-1A-НА на НА-агарозе. Оказалось, что только tRNAMet, но не HpTER со-осаждается с EF-1A-HA, что говорит об отсутствии взаимодействия между EF-1A и теломеразной РНК in vivo. Следовательно EF-1A не участвует в стабилизации HpTER. Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что стабилизация 3’-конца теломеразной РНК H. polymorpha происходит по механизму, не включающему взаимодействие с какими-либо белками, а, скорее всего, опосредована формированием пространственной структурой РНК. Планировалось изучить влияние белка Est3 на теломеразную активность in vitro. Из штаммов дикого типа и штамма Δest3 получали препараты, обогащённые теломеразой. Оказалось, что, в то время как ДЭАЭ-фракции полученные из клеток дикого типа содержат активную теломеразу, аналогичные фракции из штамма Δest3 вовсе не имеют активной теломеразы. Также был создан штамм, в котором белок hpEst2 модифицирован добавлением аффинного эпитопа на С-конец (штамм hpEst2-HA). Из данного штамма и из штамма с дополнительной делецией гена est3 методом аффинной хроматографии на НА-агарозе в мягких условиях выделили белок hpEst2-HA, а следовательно активную теломеразу. Вестерн блот анализ показал, что из hpEst2-HAΔest3 также выделяется белок hpEst2-HA, хотя и гораздо меньшей эффективностью, чем из штамма с геном EST3. Мы измерили активность полученных препаратов теломеразы в реакции удлинения ДНК-субстрата и обнаружили, что из штамма hpEst2-HA теломераза имеет высокую активность (наблюдали присоединение 24 и более нуклеотидов). Напротив, препарат теломеразы, выделенной из штамма hpEst2-HAΔest3 оказался вовсе неактивным, несмотря на присутствие в препарате белка hpEst2-HА. Таким образом, результаты анализа активности теломеразы в ДЭАЭ-фракциях и препаратах после аффинной очистки согласуются между собой и свидетельствуют в пользу важности белка hpEst3 в составе теломеразного комплекса для активности in vitro у H. polymorpha.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".