Результаты этапа: Согласно данным научной литературы, в начале кодирующих областей большинства генов, особенно высокоэкспрессируемых, находится участок, не благоприятствующий эффективной трансляции, содержащий редкие кодоны и элементы вторичной структуры. Якобы, этот «разгонный» участок нужен для замедления рибосом в начале кодирующей области, чтобы не создавать "очередей" из рибосом на других участках мРНК. Нашей задачей была проверка гипотезы «разгонного участка».
Мы использовали репортерные конструкции, в которых менялось начало области, кодирующей флюоресцентный белок CER, а ген флюоресцентного белка RFP, находящийся на той же плазмиде, был использован в качестве внутреннего контроля.
Мы создали обширную библиотеку конструкций, в которой первые 10 кодонов гена CER полностью случайны. С помощью клеточного сортера вся библиотека транcформированных бактерий была разделена на основе эффективности трансляции CER. Получилось семь библиотек, ранжированных по эффективности трансляции. Эти библиотеки были подвержены высокопроизводительному секвенированию.
В ходе анализа мы исследовали частоты редких кодонов в начальном участке кодирующей области CER для каждой из библиотек, сортированных по эффективности трансляции. Мы обнаружили очевидное подтверждение гипотезы о том, что эффективно транслирующиеся мРНК содержат больше редких кодонов в начале кодирующей области, чем плохо транслируемые, в то время, как вероятность образования вторичных структур в начале кодирующей области мРНК возрастает с падением эффективности трансляции.
Таким образом, оказалось, что гипотеза разгонного участка мРНК подтверждается в отношении частоты встречаемости редких кодонов, и не подтверждается в отношении элементов вторичной структуры. |