Деметилирование ДНК: поиск новых противораковых препаратовНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. Деметилирование ДНК: поиск новых противораковых препаратов
Результаты этапа: В раковых клетках наблюдается гиперметилирование промоторных областей генов-супрессоров опухолей. Ингибиторы ДНК-метилтрансфераз вызывают реактивацию этих генов, что позволяет рассматривать ДНК-метилтрансферазы как мишени для противораковой терапии. Ранее нами показано, что димерные бисбензимидазолы DB(n), различающиеся длиной олигометиленового линкера между двумя бисбензимидазольными фрагментами (n – число метиленовых групп в линкере), эффективно ингибируют метилирование ДНК-дуплексов метилтрансферазой мыши Dnmt3a. За отчетный год изучена цитотоксичность некоторых из этих соединений, их способность проникать в клетки и их влияние на общее метилирование геномной ДНК в эмбриональных фибробластах легкого (Ф-977) и клетках рака шейки матки (HeLa). Показано, что в диапазоне концентраций 0–60 мкМ только соединение DB(11) оказывает значительное токсическое действие на нормальные клетки, в случае раковых клеток токсический эффект исследованных DB(n) был незначительным. Интересно, что DB(3) незначительно стимулирует пролиферацию Ф-977 и в некоторой степени подавляет рост HeLa, что делает его наиболее привлекательным в качестве потенциального лекарства. Соединения DB(1) и DB(3) проникают в ядра клеток HeLa и Ф-977 и накапливаются преимущественно в ядрышке и/или в сближенных с ядрышком участках ядра, а DB(11) не способен проникать в ядра этих клеток. Исследовано влияние DB(n) на общий уровень метилирования геномной ДНК в клетках HeLa, используя 26µM как DB(3), так и DB(1), а в клетках Ф-977 – только DB(3). Общий уровень метилирования геномной ДНК в обоих типах клеток остается без изменений. Однако это не исключает возможности влияния DB(n) на метилирование тех участков генов, которые изначально гиперметилированы и локализуются в обнаруженных нами районах преимущественного накопления DB(n) в клетках, что будет исследовано в дальнейшем. С целью повышения эффективности связывания DB(n) с ДНК синтезированы их производные, структуры которых содержат положительно заряженные остатки пиперазина.
2 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Деметилирование ДНК: поиск новых противораковых препаратов
Результаты этапа: В текущем году продолжена разработка DB(n) как ингибиторов МТаз. Определены параметры комплексообразования DB(n) с 30-звенными ДНК-субстратами в условиях образования разных типов комплексов и показано, что лиганд в открытой линейной форме обладает большими ингибирующими свойствами благодаря большему сродству к ДНК. Показано, что ингибирование метилирования обусловлено связыванием DB(n) с ДНК, а не с МТазами. Продолжено исследование проникновения и локализации DB(n) в нормальных и раковых клетках. Как и в случае клеток HeLa и фибробластов Ф977, DB(1) и DB(3) проникают внутрь клеток рака молочной железы MCF-7 и преимущественно локализуются в ядрышке и/или в сближенных с ядрышком участках ядра. В целом, DB (n) не токсичны для нормальных клеток, но отмечена токсичность DB(3) в отношении клеток MCF-7. Для изучения влияния DB(n) на метилирование отдельных участков геномной ДНК выбран участок гена 18S рРНК, который находится в районах преимущественного накопления DB(1) и DB(3). Он представляет собой часть рибосомного повтора, который входит в состав ядрышкообразующих районов хромосом и гиперметилирован. Показано, что в клетках HeLa при инкубировании с DB(1) или DB(3) снижается уровень метилирования этого участка гена 18S рРНК. Аналогичный эффект вызывает DB(3) в клетках Ф977. Исследовано ингибирующее действие новых соединений - димерных бисбензимидазолов, содержащих пиперазиновый цикл в олигометиленовом линкере, соединяющем бисбензимидазольные фрагменты (DBP(n), n=1-4) в реакции метилирования МТазой M.SssI ДНК фага ? и 30-звенного ДНК-дуплекса с одним СpG-сайтом. Все соединения DBP(n) показали ингибирующий эффект при концентрации 200 мкМ. По предварительным данным значения IC50 составляют 35-40 мкМ для DBP(1) и 45-50 мкМ для DBP(3).
3 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Деметилирование ДНК: поиск новых противораковых препаратов
Результаты этапа: В раковых клетках наблюдается гиперметилирование промоторных областей генов-супрессоров опухолей. Ингибиторы ДНК-метилтрансфераз (МТаз) вызывают реактивацию этих генов и являются средствами для противораковой терапии. Поэтому весьма актуален поиск и характеристика новых ингибиторов МТаз. Ранее нами показано, что димерные бисбензимидазолы DB(n), где n – число метиленовых групп в линкере, соединяющем бисбензимидазольные фрагменты, эффективно ингибируют метилирование ДНК-дуплексов каталитическим доменом МТазы мыши Dnmt3a. В настоящем гранте продолжена разработка DB(n) как ингибиторов МТаз и получена и детально исследована серия новых димерных бисбензимидазолов - DBP(n), в которые для улучшения растворимости в воде в структуру олигометиленового линкера введён остаток 1,4-пиперазина. Для соединений DBP(1-4) показана способность ингибировать в микромолярных количествах реакцию метилирования 30-звенного ДНК-субстрата А прокариотической МТазой M.SssI, которая как и МТазы млекопитающих, узнает и метилирует в ДНК CpG-сайты. При этом существенных различий в ингибирующей активности между соединениями этой серии не обнаружено. Ингибирование метилирования обусловлено связыванием DB(n) и DBP(n) с ДНК (определены соответствующие константы диссоциации), а не с МТазами. DBP(4) менее эффективно, чем DB(11), ингибирует метилирование субстрата А МТазой M.SssI (эти соединения изогеометричны). Соединения DB(n), за исключением DB(11), проникают внутрь клеток фибробластов Ф977, HeLa и рака молочной железы MCF-7 и преимущественно локализуются в ядрышке и/или в сближенных с ядрышком участках ядра. DB(n) не токсичны для нормальных клеток, но отмечена токсичность DB(3) в отношении клеток MCF-7. Проникновение в клетки и распределение в клетках DBP(1-4) похоже на DB(n). В концентрации 20 мкМ все четыре соединения оказались нетоксичны для клеток. Введение DB(n) не сказывается на общем уровне метилирования геномной ДНК в клетках HeLa и Ф-977; DBP(n) оказывают небольшой деметилирующий эффект в клетках MCF7. Исследовано влияние DB(n)и DBP(n) на метилирование выбранных участков геномных ДНК. В клетках HeLa при инкубировании с DB(1) или DB(3) снижается уровень метилирования участка гена 18S рРНК, который входит в состав ядрышкообразующих районов хромосом и гиперметилирован. Аналогичный эффект вызывает DB(3) в клетках Ф977. Показана способность DBP(n) уменьшать степень метилирования промоторных областей генов-супрессоров опухолей RARB и PTEN. Получены первые данные о реэкспрессии некоторых генов-супрессоров опухолей. Так, DBP(1) способствуют реэкспрессии генов CDKN2A, Apaf-1, RUNX3, APC и RARB, «молчащих» в клетках рака молочной железы MCF7 из-за гиперметилирования промоторных областей. Полученные данные in vitro и в клетках позволяют рассматривать димерные бисбензимидазолы разной структуры как деметилирующие препараты для противораковой терапии. Этот вопрос требует дальнейшего изучения с использованием различных линий опухолевых клеток, анализа уровня метилирования других гиперметилированных участков ДНК и детального рассмотрения реэкспрессии «молчащих» генов. Дальнейший интерес к этим соединениям обусловлен также обнаруженым нами их необычайным свойством избирательно и очень эффективно ингибировать трипсиноподобную активность иммунопротеасомы.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".