ИСТИНА

Альбумин является основным белком плазмы крови и выполняет в организме транспортные функции, связывая широкий ряд веществ-лигандов (лекарства, токсины, ионы металлов и др.). Характеристики процесса связывания определяются в общем случае параметрами сайтов связывания – фрагментов молекулы, ответственных за взаимодействие с лигандами – их числом n и константой комплексообразования K, которые, в свою очередь, зависят от окружения белка и его конформации. Помимо фундаментальной задачи, заключающейся в исследовании геометрии сайтов связывания и механизмов межмолекулярного взаимодействия, актуальной проблемой является оценка эффективности связывания белком лигандов для, например, нужд фармакокинетики. Одним из наиболее распространенных методов решения этой задачи является применение флуоресцентной спектроскопии, в частности, измерение тушения собственной флуоресценции белка при добавлении к нему лиганда, основанное на применении классического или модифицированного уравнения Штерна-Фольмера. При этом данные, полученные с использованием этого подхода, часто находятся в противоречии с данными других методов (калориметрии, диализа и т.д. – см. примеры несовпадений в обзоре современного состояния исследований) - например, значения констант комплексообразования могут отличаться на несколько порядков. Данный факт связан, во-первых, с тем, что обычно квантовый выход флуоресценции белка, связавшего один лиганд, считается равным нулю, а, во-вторых, с недостаточно полным описанием кинетики процесса связывания. В данном проекте предполагается проведение всестороннего исследования проявление межмолекулярного взаимодействия при связывании альбумином лигандов в их флуоресцентных и структурных характеристиках, а также разработка комплексного флуоресцентный подхода и математической модели, позволяющих корректно определять характеристики сайтов связывания. Для этого будет применен набор оптических методов (классическая и время-разрешенная флуориметрия, абсорбционная и ИК-спектроскопия, спектроскопия упругого рассеяния света), а также использована как собственная флуоресценция белка, так и флуоресценция лигандов, в частности, катиона европия (III). В заявляемом проекте исследование связывающей способности альбумина будет изучено на примере ионов тяжелых металлов, так как данная модельная система обладает большим числом сайтов связывания (порядка 10), характеризующимися различными механизмами взаимодействия, что позволит протестировать адекватность разработанного метода диагностики.

В результате выполнения проекта получены следующие научные результаты: - Исследовано изменение конформации альбумина при его взаимодействии с ионами тяжелого металла европия(III) методом флуоресцентной спектроскопии. Определены вклады различных механизмов в процесс тушения флуоресценции белка в результате его конформационных изменений при связывании с лигандом. - Определены ключевые характеристики процесса связывания – число сайтов (центров) связывания и константы комплексообразования – белка альбумина с солью тяжелого металла европия(III) методом флуоресцентной спектроскопии с использованием как собственной (триптофановой) флуоресценции альбумина, так и флуоресценции европия(III). Обнаружено, что число сайтов связывания альбумина n и значение константы комплексообразования Ka, полученные из обоих методов, дают качественно разные результаты: например, методом тушения флуоресценции альбумина было получено, что n=1 для pH 6 и pH 4.5, в то время как метод флуоресценции европия(III) показал наличие двух типов сайтов связывания с n1=2, n2=4 при pH 6 и n1=1, n2=2 при pH 4.5. - Разработана математическая модель, описывающая кинетику процесса связывания белка с лигандом и позволяющая рассчитывать кривые тушения флуоресценции с использованием двух моделей комплексообразования: а) Модели ступенчатого (или пошагового) связывания лигандов, в которой предполагается наличие флуоресценции у комплекса белок-лиганд и зависимости его квантового выхода флуоресценции от числа связанных лигандов и конформации белка. Данная модель используется в экспериментах по тушению собственной флуоресценции белков и, соответственно, при построении модифицированных графиков Штерна-Фольмера. б) Модели независимых сайтов связывания, в которой предполагается наличие разных независимых друг от друга сайтов связывания, характеризующихся разными константами комплексообразования у одной молекулы белка, при этом считается, что присоединение лиганда к сайтам связывания одного типа происходит с равной вероятностью. Данная модель обычно используется при анализе экспериментальных данных с помощью графиков Скетчарда (эксперименты по диализу, калориметрии, потенциометрии и др.) - Проведено моделирование флуоресцентного отклика, в том числе, тушения флуоресценции альбумина при связывании им лигандов-тяжелых металлов. -- Исследована зависимость эффективности тушения флуоресценции от локального распределения молекул тушителя по центрам связывания белка. Показано, что эффективность тушения собственной флуоресценции белка зависит как от концентрации добавляемого лиганда, так и от объема, который добавляется к раствору белка. - Подробно исследован процесс агрегации, происходящего в растворах макромолекул альбумина при воздействии различных параметров среды (концентрации белка, ионной силы, pH), в том числе при воздействии ионов лантанидов (включая европий(III)), методами абсорбционной спектроскопии, динамического светорассеяния и флуоресцентной спектроскопии.