ИСТИНА

Цель: выделение в электрофоретически гомогенном состоянии соматического АПФ из семенной жидкости и тестикулярного АПФ (С-домен) из сперматозоидов человека; определение кинетических параметров гидролиза FRET-субстратов в модельной среде под действием трех форм АПФ; разработка методики определения активности АПФ в биологических жидкостях с использованием FRET-субстратов; расчет констант ингибирования однодоменных форм АПФ соответствующими домен-специфичными ингибиторами в модельной среде; изучение эффективности связывания панели мАт к конформационным эпитопам на обоих доменах АПФ в присутствии "короткого" лиганда - эналаприлата и "длинного" лиганда - тепротида для выявления индуцированных лигандами конформационных изменений в структуре фермента.

Определены кинетические параметры гидролиза трех FRET-субстратов с различной доменной специфичностью под действием трех форм АПФ – соматической двудоменной и отдельных N- и С-доменов. Показано, что при гидролизе FRET-субстратов под действием двудоменной формы АПФ активные центры, расположенные на разных доменах фермента, демонстрируют полностью взаимозависимый механизм функционирования, то есть в каждый момент времени фермент может связать только одну молекулу субстрата. Отрицательная кооперативность активных центров АПФ в реакциях гидролиза FRET-субстратов подтверждена при исследовании ингибирования активности фермента ингибиторами различной структуры: аналогами ди- и трипептидов, не обладающими доменной специфичностью и нонапептидом тепротидом, специфичным к С-домену. На основании полученных данных предложена формально-кинетическая схема совместного функционирования активных центров в составе двудоменной формы АПФ. Впервые проведено исследование влияния ингибиторов АПФ различной структуры на эффективность связывания моноклональных антител (мАт) с N- и С-доменами фермента. Выявлены кардинальные отличия в связывании нескольких мАт с комплексами АПФ-«короткий» ингибитор и АПФ-«длинный»ингибитор, что указывает на различные конформационные изменения в молекуле фермента при связывании лигандов различной структуры. Проведен молекулярный докинг тепротида в активные центры однодоменных форм АПФ. Показано, что при связывании с N-доменом АПФ тепротид претерпевает значительные конформационные изменения, что, вероятно, объясняет разницу в константах связывания тепротида с доменами фермента. Анализ третичных структур комплексов N-домена АПФ с различными ингибиторами выявил различия в области остатка Y560, что может объяснять различия в эффекте различных лигандов на связывание мАт. Получены данные, указывающие на присутствие в крови человека как эндогенных ингибиторов АПФ с молекулярной массой менее 3 кДа, так и эффекторов, влияющих на доступность эпитопов связывания ряда мАт.