Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливыНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 31 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы
Результаты этапа: Определены полные последовательности генома 8 изолятов вируса оспы сливы (Plum pox virus, PPV), относящихся к штамму W (P2, P3, Pd2, RD4, STNB1, STNB2, 1410-1, 1410-7), 4 изолятов штамма С (Bg6, Bg26, Bg66, Pul), 5 изолятов штамма CR (Kp8-1U, Kp8-2U, Fl-3, Pul-1, Pul-DS) и 2 изолятов штамма Rec (K28, Kisl-1pl). Рекомбинационный анализ полногеномных последовательностей изолятов штамма W с помощью программы RDP4 впервые выявил у PPV наличие и широкое распространение внутриштаммовых рекомбинационных событий. Все 8 изолятов PPV-W, секвенированных в данной работе, оказались рекомбинантами. Впервые обнаружено, что универсальный эпитоп 96DRDVDAG102, общий для всех исследованных в этом отношении изолятов PPV (кроме ряда изолятов нового штамма CR), у двух представителей штамма C (Bg6 и Bg26) изменен в результате мутации D96E (Таблица). Эти изоляты не определяются методом иммуноферментного анализа с моноклональными антителами 5B, которые специфичны к универсальному эпитопу и распознают, как считалось, любые изоляты этого вируса. Впервые описаны симптомы на плодах вишни, зараженной изолятами нового штамма PPV-CR, которые проявлялись в виде оспин и растрескивания плодов. Впервые в России и на территории бывшего СССР выявлены 2 природных изолята PPV, относящихся к штамму Rec. Изолят К28 обнаружен на алыче Prunus cerasifera в коллекционных насаждениях Никитского ботанического сада (Крым), а изолят Kisl-1pl – на сливе P. domestica на дачном участке в окрестностях Кисловодска. Полные последовательности их геномов депонированы в GenBank под номерами KF472134 и KM273015, соответственно. Рекомбинационный анализ полногеномных последовательностей K28 и Kisl-1pl, а также 7 других изолятов штамма Rec, доступных в GenBank, с помощью программы RDP4 впервые выявил рекомбинационное событие в 5’-конце генома всех исследованных изолятов штамма Rec в районе генов P1 и HcPro. При обследовании насаждений косточковых культур обнаружено свыше 30 новых изолятов штамма D. Несколько представителей этого штамма обнаружены на персике (P. persica) и нектарине (P. persica var. nectarine), которые не являются типичными хозяевами для изолятов этого штамма, а ряд изолятов не распознавались моноклональными антителами 4DG5/4DG11 к эпитопу 56PATKP60, специфичному для штамма D.
2 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы
Результаты этапа:
3 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы
Результаты этапа: 1) Открыта новая группа изолятов PPV, адаптированных к вишне (Prunus cerasus), и охарактеризованы их молекулярно-биологические свойства. При исследовании коллекционных насаждений и сортоиспытательных участков вишни Татарского НИИ сельского хозяйства (г. Казань) обнаружены необычные изоляты PPV, названные, в соответствии с их локализацией, Tat (татарскими) изолятами. Tat изоляты индуцировали на листьях зараженных растений симптомы, типичные для PPV, и выявлялись методом иммуноферментного анализа (ИФА) с поликлональными антителами к PPV и моноклональными антителами 5В, а также методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с универсальными праймерами P1/P2 и праймерами, специфичными к 3'-нетранслируемому участку генома (3'-NCR). По многим важным параметрам Tat изоляты обладали высоким сходством со штаммами C и CR, вероятно, ввиду предполагаемой общности происхождения и адаптации к одному и тому же хозяину. Однако, они не определялись в ОТ-ПЦР с праймерами к штаммам С и CR (которые только и были описаны ранее на вишне), а также с праймерами к штаммам M и W. В то же время, некоторые из этих изолятов (Tat-2, Tat-4, Tat-26) выявлялись в ОТ-ПЦР с праймерами к штамму D, который никогда не был обнаружен на вишне. Изоляты Tat-2, Tat-3 и Tat-26 реагировали в ИФА с моноклональными антителами АС, специфичными к штамму С. Ни один из Tat изолятов не распознавался моноклональными антителами 4DG5 к штамму D. Таким образом, применение иммунохимических и молекулярных методов анализа не позволило установить штамм новых изолятов. С использованием смысловых вырожденных праймеров, распознающих последовательности большинства потивирусов: NIb2F (Zheng et al., 2010) и Potyvirid primer 2 (Gibbs and Mackenzie, 1997), и известных антисмысловых праймеров 4CPR1, P1 или H1, специфичных к консервативным С-концу белка оболочки (БО) или к 3’-NCR, определена 3'-концевая последовательность генома этих изолятов длиной 1747 нуклеотидов (nt), включающая часть гена NIb, весь ген БО и большую часть 3'-NCR. Филогенетический анализ этих последовательностей показал, что Tat изоляты входят в группу "вишневых" штаммов C и CR, однако достоверно кластеризуются отдельно от них. Tat-2, Tat-4 и Tat-26 и изоляты штамма С происходят, по-видимому, от общего предка. Изоляты Tat-2 и Tat-4 оказались близкородственными. Определение генетических дистанций и степени идентичности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что дивергенция между изолятами Tat-2/4 и Tat-26 в исследуемом сегменте генома составляла более 15% на нуклеотидном уровне, что сопоставимо с междуштаммовыми различиями, характерными для PPV. Изолят Tat-3 кластеризовался отдельно как от остальных Tat изолятов, так и от штаммов С и CR. Наиболее вероятной причиной этого является рекомбинация, обнаруженная в 5'-концевом сегменте гена БО Tat-3. Рекомбинантная последовательность длиной 287 nt обладала наибольшим сходством (87%) с соответствующим сегментом генома изолята Volk143, относящимся к штамму C. Точное филогенетическое положение Tat-3 еще предстоит определить. Новые изоляты PPV, по-видимому, не относятся ни к одному из известных штаммов вируса и представляют собой отдельные дивергентные линии эволюции. Для решения этого вопроса необходим анализ полногеномных последовательностей. Полная последовательность генома 4 Tat изолятов была определена посредством секвенирования нового поколения на платформе Illumina с использованием геномного секвенатора HiSeq2000 и его программного обеспечения. В отсутствие надежной референсной последовательности контиги собирали de novo. Некоторые результаты исследований Tat изолятов доложены на 3 Международном симпозиуме по вирусу оспы сливы (3rd International Symposium on Plum pox Virus) 9 - 13 мая 2016 г., Анталья, Турция, и представлены для опубликования в журнале Virology. 2) В коллекционных насаждениях вишни Татарского НИИ сельского хозяйства (г. Казань) обнаружены 20 новых изолятов PPV штамма С (PPV-C). Впервые обнаружена природная инфекция PPV-С на войлочной вишне (P. tomentosa). Определены 3'-концевые последовательности генома новых изолятов длиной около 1300 nt с использованием известной пары праймеров p84С/4CPR1. Определены полные последовательности генома 3 татарских изолятов PPV-C (Tat-7, Tat-15 и Tat-23) посредством секвенирования нового поколения на платформе Illumina с использованием геномного секвенатора HiSeq2000 и его программного обеспечения и полногеномной референсной последовательности изолята BY181.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".