ИСТИНА

В 2014-2016 году найден ряд эффективных конъюгатов противоопухолевых препаратов нацеленных на терапию аденокарциномы предстательной железы, а так же препараты для лечения метаболических заболеваний печени. Оптимизирован синтез новых лигандов асиалогликопротеинового рецептора (ASGPR). Наилучшие показатели аффинности по отношению к рецептору показал лиганд разветвленного строения с тремя остатками аллилгликозида-N-ацетилгалактозамина (KD = 0.76 нМ). Также предложен новый лиганд ASGPR неуглеводной природы, содержащий хинолиновый фрагмент (KD = 327 нМ). Аффинность обоих соединений превосходит показатель для эндогенного лиганда N-ацетилгалактозамина (KD = 448 мкМ). Оптимизирована процедура получения ковалентных конъюгатов доксорубицина, метотрексата и паклитакселя с производными N-ацетилгалактозамина и N-ацетилглюкозамина с использованием различных синтетических подходов. Для паклитаксела была проведена оптимизация условий этерификации 5-гексиновой кислотой с получением производных, замещенных в положение 7-ОН и в фенилизосериновый фрагмент исходной структуры. На примере метотрексата предложен метод, в котором молекула противоопухолевого препарата выступает в качестве платформы для построения разветвленных гликоконъюгированных систем. Осуществлено взаимодействие аторвастатина с лигандами ASGPR на основе производных N-ацетилгалактозамина, содержащими концевую аминогруппу. Образование конъюгата аторвастатина было зафиксировано методом ВЭЖХ/МС. Все полученные конъюгаты терапевтических молекул оказались стабильными в физиологических условиях. Для последующих экспериментов in vivo на крысах Wistar с трансплантированным подкожно альвеолярным слизистым раком печени РС-1, были получены конъюгаты N-ацетилгалактозамина и N-ацетилглюкозамина с флуоресцентным красителем Sulfo-Cy5. Показано, что конъюгаты на основе N-ацетилгалактозамина проникают в клетки рака печени на порядок лучше в сравнении с производными N-ацетилглюкозамина. Синтезированные конъюгаты не проявили токсичности in vivo. Предложена модель ранней диагностики рака печени in vivo с использованием лигандов ASGPR. Было показано, что добавление биотина и/или хлорида кальция в клеточную среду при культивации линии гепатоцеллюлярной карциномы Huh7 со сниженной экспрессией ASGPR способствует увеличению количества рецепторов на поверхности, что ведет к повышенному проникновению лигандов внутрь гепатоцитов. На примере конъюгата лиганда ASGPR(7) с модельной анти-AHA1 миРНК было показано, что добавление хлорида кальция и/или биотина способствует проникновению конъюгата в клетки Huh7 и наблюдается падение уровня экспрессии гена-мишени в 3-5 раз при одинаковой концентрации миРНК. Получена серия адресных конъюгатов доксорубицина и лигандов ПСМА, выявлено соединение-лидер (19) с pH расщепляемым линкером. Методом ВЭЖХ/МС был оценен период полураспада конъюгата при pH 5.0 и 7.4, значения составили 1.25 ч (pH 5.0) и 50 ч (pH 7.4), что подтверждает возможность расщепления целевых конъюгатов в эндосомах с высвобождением лекарственного препарата доксорубицин в свободном виде при рецептор-опосредованным эндоцитозом. Синтезирована серия конъюгатов паклитаксела, модифицированного остатками 5-гексиновой кислоты (в положение 7-ОН и в фенилизосериновый фрагмент) с различными лигандами ПСМА. Исследована цитотоксичность полученных конъюгатов на клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и PC3, изучена зависимость «структура-активность» цитотоксического действия конъюгатов. Цитотоксическая активность конъюгата с амидной связью между линекром и ПСМА-лигандом (IC50 = 25 нМ) на порядок выше, чем у конъюгата с сочленением через фрагмент мочевины (IC50 = 1670 нМ). Продемонстрировано предпочтительное сочленение фрагментов-линкеров и ПСМА-лигандов в структуре конъюгата через амидную связь по сравнению с сочленением через фрагмент мочевины. Все лиганды и конъюгаты в данной работе были выделены в индивидуальном виде и охарактеризованы методами спектроскопии 1H и 13С ЯМР , масс-спектрометрии высокого разрешения и ВЭЖХ/МС. Была изучена экспрессия ПСМА в клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP, PC3, MCF-7 и HEK-293 методом проточной флуориметрии с использованием ранее синтезированного флуоресцентного конъюгата (Lys-urea-Glu-Cy5), способного визуализировать ПСМА. Была обнаружена флуоресценция большей части клеток линии LNCaP (89%), большей части клеток MCF-7 (65%) и незначительный сигнал флуоресценции для линий PC3 (1%) и HEK-293 (13%). Показано, что конъюгат Glu-urea-Lys-Cy5 накапливается в цитоплазме клеток LNCaP, чего не происходит на клеточной линии PC3. Впервые показано, что клеточная линия MCF-7, также содержит биомолекулы, способные селективно взаимодействовать с лигандами ПСМА. Методом лентивирусной трансфекция клеточной линии PC3 была получена клеточная линия PC3-PIP (ПСМА+). С использованием клеточной линии PC3-PIP получена ксенографтная мышиная модель рака предстательной железы, на которой проводилось исследование активности конъюгата-лидера in vivo. Было выявлено наличие противоопухолевого эффекта адресного конъюгата доксорубицина по сравнению с контрольной группой. Однако выявленный эффект оказался меньше в сравнении со свободным препаратом доксорубицин, что объясняется недостаточной экспрессией ПСМА в культуре клеток PC3-PIP. Для ряда полученных конъюгатов паклитаксела была исследована цитотоксичность на клеточных линиях LNCaP (ПСМА+) и PC3 (ПСМА-). Конъюгаты с амидным сочленением показали цитотоксичность (IC50 = 25 нМ и 86 нМ), близкую к соответствующим значениям препарата паклитаксел, однако проявили низкую избирательность к ПСМА-экспрессирующей клеточной линии. Конъюгат с мочевинным сочленением показал высокую избирательность по отношению к ПСМА-положительной клеточной линии, что перспективно для дальнейших in vivo исследований. Таким образом, установлено соотношение «структура конъюгата – активность» для конъюгатов паклитаксела с лигандами ПСМА. Синтезированы смысловые цепи ASHA-T XXX-g-g-Af-u-Gf-a-Af-g-Uf-g-Cf-a-Gf-a-Uf-u-Af-g-Uf-invdT и Luc-T XXX-c-u-Uf-a-Cf-g-Cf-u-Gf-a-Gf-u-Af-c-Uf-u-Cf-g-Af-invdT, содержащая на 5’-конце три фрагмента гидроксипролинола, модифицированного 5-гексиновой кислотой. Последующее присоединение азидо производного, содержащее три остатка N-ацетилгалактозамина, позволило ввести в состав конъюгата сразу девять остатков N-ацетилгалактозамина. Были синтезированы конъюгаты коротких интерферирующих РНК, ингибирующих экспрессию терапевтически значимого белка ApoB. Было показано, что уже при 30 нМ концентрации РНК наблюдается эффективное ингибирование экспрессии АроВ в свежевыделенных гепатоцитах мышей. Было отмечено, что добавлении избытка лиганда или хелатирующего агента (EGTA) резко снижает эфекктивность ингибирования. Были синтезированы короткие интерферирующие РНК, направленные на мРНК транстиретина. Среди синтезированных структур, были выбрана структуры-лидеры. Получены конъюгаты миРНК и 2’-OMeРНК (ядрышковая последовательность комплементарная к U3 РНК) с лигандами ПСМА на основе уреида лизина и глутаминовой кислоты. Состав конъюгатов подтвержден методом масс-спектрометрии, индивидуальность с помощью ВЭЖХ. Впервые методом флуоресцентной микроскопии показано, что конъюгат лигандов ПСМА с 2’-OMeРНК к U3 РНК может быть использован для визуализации ядрышек клеток рака предстательной железы. Данный подход универсален и представляет интерес для создания адресных конъюгатов для визуализации in vitro. Впервые продемонстрирован метод адресной доставки миРНК к мРНК AHA1 в культуре LNCaP. Был продемонстрирован 95% нокдаун мРНК AHA1 после инкубации культуры LNCaP с конъюгатом лиганда ПСМА рецептора с миРНК в концентрации 8 мкМ. Данный подход открывает возможность адресной доставки терапевтической миРНК в клетки рака предстательной железы. В рамках выполнения проекта РНФ в Ломоносовском корпусе МГУ имени М.В. Ломоносова открыта новая лаборатория "Тканеспецифических лигандов". В лаборатории могут быть реализованы полноценные исследования от дизайна структуры молекулы до отбора кандидатов предклинических испытаний для лечения социально-значимых болезней.