| 1 |
3 февраля 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Грант РФФИ: Изучение эффектов и путей проведения сигнала новых агонистов и антагонистов прогестерона, осуществляемых через мембранные рецепторы, в культурах клеточных линий человека |
| Результаты этапа: В связи с главной фундаментальной задачей проекта – изучением действия новой группы прогестинов, синтезируемых в ИОХ, для выявления селективных агонистов и антагонистов прогестерона в отношении мембранных рецепторов, в 2014 году: 1) К уже полученным 4м 3–О-метоксииминопроизводным прогестерона был синтезирован один запланированный в проекте стероид -19-гидроксипрогестерон, который является промежуточным продуктом для синтеза двух других запланированных к изучению соединений - (E)- и (Z)- 3-O-метоксиимино-19-гидроксипрегн-4-ен-20-онов. Поскольку сначала была выбрана последовательность реакций, приводящая к низкому выходу 19-гидроксипрогестерона, его не хватило для продолжения синтеза. В последствии последовательность реакций была изменена, и полученный в достаточном количестве, он послужил материалом для первой стадии синтеза (E)- и (Z)- 3-O-метоксиимино-19-гидроксипрегн-4-ен-20-онов. Сейчас синтез этих соединений близок к завершению; 2) экспрессированы человеческие мембранные рецепторы бета и гамма в дрожжевых клетках для изучения связывания их с синтезированными соединениями. Определено сродство уже имеющихся 4х 3 –О-метоксииминопроизводных прогестерона к мембранному рецептору альфа и ядерному рецептору прогестерона из матки крыс. Индекс дискриминации, определяющий разницу в связывании стероида мембранным и ядерным рецепторами, у (Е)3-О-метоксииминопрогестерона составил 89, что превосходит значения используемых в зарубежных лабораториях Org OD 02-0 (10-ethenyl-19-norprogesterone) и Org OD 13-0 (19a-methylprogesterone) индексы дискриминации mPRalhpa/nPR которых - 20 и 40, соответственно; 3) подготовлена модельная дрожжевая система для тестирования агонистической и антагонистической активности синтезированных в ИОХ новых аналогов прогестерона в отношении ядерного рецептора человека путем определения уровня транскрипции репортерного гена. Отработан метод определения этой активности в присутствие возрастающих концентраций прогестерона. Подобрана оптимальная плотность засаживаемых клеток, время инкубации с гормоном, диапазон концентраций стероидов для обработки клеток. С добавлением возрастающих концентраций прогестерона происходило дозозависимое возрастание бета-галактозидазной активности в инкубируемой смеси ; 3) Проверены 13 культур клеточных линий человека на наличие экспрессии генов ядерного и трех мембранных рецепторов для отбора наиболее перспективных объектов исследования методом ПЦР в реальном времени. Особенно высокий уровень мРНК мембранных рецепторов выявляется в клеточной линии BxPC3 аденокарциномы поджелудочной железы, в то время как мРНК ядерных рецепторов здесь не обнаруживается. Эта культура является перспективным объектом для исследования эффектов прогестинов на пролиферацию и апоптоз, опосредуемых пулом мембранных рецепторов. Результаты этой части работы были доложены и опубликованы в виде тезисов на IV съезде физиологов СНГ; 4) Отобрана линия опухолевых клеток, перспективная для трансфекции генов мембранных рецепторов - LNCaP (карцинома простаты), где практически не экспрессируются никакие исследуемые рецепторы. Начата работа по конструированию плазмидных векторов с генами мембранных рецепторов человека для трансфекции в эти клетки, с целью изучения действия новых соединений на пролиферацию и апоптоз в опухолевых клетках человека через один тип мембранных рецепторов. |
| 2 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Грант РФФИ: Изучение эффектов и путей проведения сигнала новых агонистов и антагонистов прогестерона, осуществляемых через мембранные рецепторы, в культурах клеточных линий человека |
| Результаты этапа: Главная задача проекта – поиск селективных агонистов и антагонистов
прогестерона , в отношении мембранных рецепторов среди соединений,
синтезируемых в ИОХ, и изучение их действия на опухолевые клетки. В
связи с этим в 2015 году: 1) синтезированы следующие соединения –
изомеры олефинов (19-гидроксипрегн-4-ен-20-он и 19-гидроксипрегн-3-
ен-20-он) , 6-замещенные-16альфа,17альфа-циклогексанопрегнены {6(E)-
метоксииимино-16альфа,17альфа-циклогексанопрегн-4-ен-3бета-ол-20-он
и 6(E)-метоксиимино-16альфа,17альфа-циклогексанопрегн-4-ен-3,20-
дион} и 16альфа,17альфа-метиленопрегн-4,6-диен-3,20-дион. 2)Впервые
было изучено их взаимодействие с ядерными рецепторами прогестерона
из матки крыс и с мембранными рецепторами клеток аденокарциномы
поджелудочной железы BxPC3, неэкспрессирующей ядерные рецепторы.
Четыре первых соединения практически не связывались с ядерными
рецепторами, но конкурировали с прогестероном за связывание с
мембранными рецепторами с относительной конкурентной активностью
(ОКА) 13.3 – 22.1% от прогестерона 2) В модельной дрожжевой системе
протестированы агонистическая и антагонистическая активности 18
соединений, синтезированных в ИОХ, в отношении ядерного рецептора
человека путем определения уровня транскрипции репортерного гена
бета-галактозидазы; 3) Проделана работа по разработке системы
тестирования агонистической активности прогестинов в отношении
мембранного рецептора прогестерона альфа человека . Для этого
осуществлена трансформация дрожжей штамма CRY сразу двумя
плазмидами: экспрессионной, несущей ген человеческого мембранного
рецептора альфа, и репортерной, несущей ген бета-галактозидазы под
промотором FET- гена дрожжей, экспрессия которого зависит от
активности сигнальных путей семейства PAQR – белков, к которым
относятся мембранные рецепторы прогестерона. Однако в контрольном
эксперименте прогестерон подавлял активность FET- промотора в
отсутствие экспрессии mPR alpha. Причины выясняются; 4)Подобраны
условия культивирования клеток BxPC3 и SKOV-3 (количество пассажей,
пересадка в бесстероидную среду без фенолового красного), изучена
динамика экспрессии различных типов рецепторов при культивировании;
5)подобраны концентрации прогестерона и время инкубации с ним,
подобраны и синтезированы праймеры для определения экспрессии
факторов пролиферации и апоптоза, методом ПЦР в реальном времени
определены уровни мРНК этих факторов в присутствии разных
концентраций прогестерона и в его отсутствии через 24, 48 и 72 часа
инкубации; 6) получены 3 векторных конструкции, несущие 3 разных гена
мембранных рецепторов прогестерона человека; 7) для отбора
трансфецированных клеток от клеток, не несущих плазмиду проверено
влияние среды с разными концентрациями антибиотика G 418 на
жизнеспособность клеток и , таким образом, выбраны условия
культивирования трансфецированных клеток. Опубликованы 2 статьи по
теме гранта и принята к печати третья статья. Материалы исследования
агонистической активности синтезированных в ИОХ аналогов
прогестерона были доложены и опубликованы в виде тезисов на 21
конгрессе “Innovation in reproductive medicine” в Германии (Франкфурт). |
| 3 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Грант РФФИ: Изучение эффектов и путей проведения сигнала новых агонистов и антагонистов прогестерона, осуществляемых через мембранные рецепторы, в культурах клеточных линий человека |
| Результаты этапа: Прогестины могут оказывать разнонаправленные эффекты на клетки в зависимости от типа активируемых ими рецепторов – ядерных (nPR), мембранных рецепторов прогестерона (mPR) или сенсоров, а также рецепторов других стероидных гормонов (nSR). Наименее изучены эффекты прогестерона, осуществляемые через mPR, идентифицированные в 2003 году. Однако есть данные, показывающие, что именно через них прогестины могут оказывать противоопухолевое действие. Поэтому поиск селективных лигандов этих рецепторов представляется актуальной задачей эндокринологии и медицинской фармакологии. Целью проекта являлось изучение эффектов прогестинов, осуществляемых через мембранные рецепторы в опухолевых клетках культур человека. Для выполнения поставленной задачи мы провели поиск селективных лигандов мембранных рецепторов среди синтезированых в ИОХ им Н.В.Зелинского новых производных прогестерона. Были синтезированы 9 соединений. Изучены связывающие характеристики этих соединений с разными типами рецепторов, а также агонистическая и антагонистическая активности при взаимодействии с nPR-B и mPR alpha. На основании этих результатов выбраны 2 селективных лиганда мембранных рецепторов, проявляющих агонистическую активность при связывании с mPR alpha (19-гидроксипрегн-4-ен-20-он и 19-гидроксипрегн-3-ен-20-он) и не активирующих nPR. Показано, что индексы дискриминации этих соединений (52 и 80, соответственно), характеризующие предпочтительность связывания с mPR в сравнении с nPR, превышают таковые двух известных стероидов (20 и 40), описанных в литературе как наиболее селективные лиганды mPR. По результатам этой работы написана и принята в печать статья в журнале «Биохимия», которая уже доступна online на сайте журнала. Исследована экспрессия nPR и mPR в 16 клеточных линиях, большинство которых изучены в нашей работе впервые, особенно в отношении экспрессии mPR. Мы впервые показали, что в клетках линии BxPC3 аденокарциномы поджелудочной железы самая высокая экспрессия мРНК 3х типов mPR, и обнаружили сами белки. При этом мы не выявили ни мРНК, ни белка nPR в этих клетках. Нами впервые было изучено действие прогестерона, осуществляемое по-видимому через mPR, на пролиферацию и апоптоз клеток ВхРС3 в МТТ тесте, ХТТ тесте, экспрессию маркеров пролиферации Ki67, PCNA,cyclin D1, ингибиторов комплекса циклинзависимых киназ – p21 и p27, факторов апоптоза – каспаз 3 и 9, BAD, BAX, BCL2A1. В результате этой работы было показано антипролиферативное действие прогестерона в этой клеточной линии. Материалы работы опубликованы в журнале «J of Steroid Biochemistry & Molecular Biology». Сделана трансфекция векторными конструкциями, несущими гены mPR , клеток линии LNCaP аденокарциномы простаты с самой низкой экспрессией всех типов PR. После трансфекции показана высокая экспрессия мРНК разных субтипов mPR в этих клетках. Набирается и обрабатывается материал по активности пролиферации и уровню апоптоза опухолевых клеток с экспрессией разных субтипов mPR после действия прогестерона и селективных лигандов. |
