| Результаты этапа: 1. Исследовался механизм работы каталитического центра окисления воды и синтеза молекулярного кислорода в фотосистеме 2 (Mn4,Ca,O5). С использованием метода ЭПР установлена регуляторная роль периферического белка PsbO в окислении катионов марганца на высокоаффинном Mn-связывающем участке. Исследование устойчивости катионов марганца к действию восстановителей при различных рН позволило обнаружить, что марганцевый кластер содержит только один катион марганца, находящийся под контролем катиона кальция. Стабилизация этого катиона марганца катионом Са2+ обеспечивает полное окисление воды (до О2), тогда как дестабилизация приводит к редуцированию процесса окисления (вода окисляется до Н2О2). Полученные результаты позволяют предполагать, что механизм действия катиона кальция в процессе окисления воды заключается в регуляции редокс-потенциала катиона марганца. На основании полученных результатов подготовлено две статьи, одна из которых сдана в печать.
2. Известно, что активность ряда белков-ионных транспортеров плазматической мембраны эритроцитов позвоночных (K+/Cl --симпортер, Na+/K+/2Cl--симпортер, Na+/H+-антипортер и др.) зависит от степени насыщения гемоглобина кислородом (Gibson et al., 2000). Однако влияние состояния эритроцитарного гемоглобина на активность белков, участвующих в мембранном транспорте неэлектролитов, практически не исследована.
Изучалось влияние состояния гемоглобина (связывание O2 и редокс-состояние (Fe2+/Fe3+)) на активность белка водной поры-аквапорина 1 мембраны эритроцитов человека. Активность аквапорина 1 оценивалась по скорости изменения объема эритроцитов при быстром смешивании суспензии клеток с гипертоническим раствором (100 мМ градиент сахарозы). Установлено, что наименьшее значение эффективной константы скорости изменения объема характерно для эритроцитов, содержащих гемоглобин, не связанный с кислородом (2,82 с-1). Наибольшее значение (10,53 с-1) – для эритроцитов, содержащих метгемоглобин. Для эритроцитов, содержащих оксигемоглобин, значение эффективной константы скорости промежуточное (4,65 с-1). Отрабатывается методика, позволяющая исследовать механизмы влияния состояния гемоглобина на кинетику транспорта воды через мембрану эритроцитов (определение отношения поверхности клетки к объему, использование ингибиторов аквапоринов и др.).
3. Мембранный транспорт физиологически важных малых незаряженных молекул, в том числе важнейших респираторных газов (О2 и СО2) все еще остается одним из наименее изученных разделов мембранного транспорта. Это обусловлено методическими трудностями измерения трансмембранного потока незаряженных частиц, а также недостатками теоретических представлений о природе процесса. Широкий ассортимент электрических методов регистрации мембранного транспорта здесь не пригоден. В связи с этим, создан полярографический микроскоп на основе которого отработан оригинальный метод исследования транспорта кислорода через липидные мембраны. С помощью этого метода исследовано влияние структурной организации липидов мембран на формировании диффузионного сопротивления липидного бислоя. Установлены основные закономерности влияния состава и структурной организации липидов мембран на их барьерные свойства. В качестве факторов, модифицирующих барьерные свойства липидных мембран, исследовали также многовалентные катионы, образующие комплексы с отрицательно заряженными группировками полярных головок липидов. Полученные результаты свидетельствуют, что плотность упаковки липидов в мембранах является важнейшим параметром, определяющим проницаемость мембран для кислорода в нормальных физиологических условиях и при ряде патологических процессов.
4. Исследовали клеточные процессы, лежащие в основе резкого повышения рН апопласта при точечной механостимуляции зеленой растительной клетки. Показано, что образование щелочной зоны в междоузлиях Chara corallina, вызванное микроперфорацией клеточной стенки чувствительно к величине тургорного давления, ингибиторам кальциевых каналов (La3+, Gd3+, Zn2+) и ингибиторам цитоскелета (оризалин, таксол). Установлено, что зона наружного защелачивания на поверхности клетки в области микроукола асимметрична относительно точки приложения механостимула и простирается в направлении движения цитоплазмы. Выявлена задержка (≥30 с по сравнению с нормой) образования наружной щелочной зоны при генерации потенциала действия в случае микроперфорации тонопласта. Показано, что задержка обусловлена локальным снижением рН цитоплазмы (в связи с утечкой Н+ из вакуоли в области повреждения) и исчезновением движущей силы для поступления Н+ из среды в цитоплазму. Время задержки образования щелочной зоны в области микроукола определяется длительностью остановки течения цитоплазмы, вызываемой точечным повреждением тонопласта. Результаты проясняют роль потоков Ca2+ и H+ при механорецепции и микроперфорации клеточной стенки
5. Исследовали роль движения цитоплазмы в передаче фотоиндуцированных сигналов по междоузлиям клеток Chara. Установлено, что яркий импульс локального освещения (диаметр светового пятна 400 мкм, длительность 30–50 с) вызывает распространение по клетке волны возрастания флуоресценции хлорофилла F' (с амплитудой до 50% от исходного уровня), направление движения которой совпадает с вектором течения цитоплазмы в плоскости измерения. Изменение флуоресценции F' вдали от места приложения фотостимула отражает временное восстановление акцептора QA и переносчиков электронов на участке между двумя фотосистемами при постоянной интенсивности освещения. Форма сигнала флуоресценции при равномерном движении цитоплазмы аппроксимируется гауссовой кривой. Прерывание движения цитоплазмы под влиянием генерации потенциала действия вызывает затягивание переднего или заднего фронта волны изменений F' в зависимости от места нахождения распространяемого с потоком сигнала в момент остановки цитоплазмы.
6. Изучена возможность передачи сигналов о местном засолении посредством нарушения круговых (локальных) электрических токов. В опытах с междоузлиями клеток Chara, помещенными в двухсекционную камеру, показано, что воздействие 20–50 мМ NaCl на сегмент клетки длиной ~3 мм, находящийся в малом отсеке камеры, приводит к быстрым переходным изменениям мембранного потенциала в основном сегменте клетки длиной до 40 мм, омываемом стандартной средой. Вопреки сложившимся представлениям о К+ как основном потенциал-определяющем ионе в клетках растений, изменения разности электрических потенциалов при действии NaCl были больше по амплитуде, чем при действии аналогичных концентраций KCl. Результаты подтверждают участие локальных токов в дистанционной передаче сигнала о местном засолении. |
