Неклассические функции Na,K-АТФазы: регуляция инициации сигнальных путей, индуцируемых связыванием кардиотонических стероидовНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2012 г.-31 декабря 2012 г. Неклассические функции Na,K-АТФазы: регуляция инициации сигнальных путей, индуцируемых связыванием кардиотонических стероидов
Результаты этапа: Установлено, что Na,K-ATРаза выделяется из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы в состоянии, когда ее альфа1-субъединица содержит связанный глутатион (базовое глутатионилирование). Бета-субъединица Na,K-ATРазы из солевых желез также содержит связанный глутатион. В препарате из сердца крысы глутатион содержится и в альфа2-субъединице. Базовое глутатионилирование альфа1- (но не альфа2-) субъединицы в значительной степени устраняется, если фермент выделяется в присутствии дитиотреитола. Добавление окисленного глутатиона к Na,K-ATРазе in vitro приводит к развивающемуся во времени полному ингибированию активности и к увеличению уровня глутатионилирования ее альфа1-субъединицы. Ингибирование Na,K-ATРазы, содержащей альфа1-субъединицу, необратимо, выявлено два типа SH-групп фермента с константами скорости ингибирования, различающимися более чем в 10 раз. АТР, АDР и АМР защищают Na,K-ATРазу от ингибирования окисленным глутатионом, концентрация, при которой наблюдается 50% защита, составляет 0,54, 0,7 и 1,75 мМ соответственно. Методом изотермической калориметрии титрования показано, что глутатионилирование фермента предотвращает связывание с ним АDP. Методом масс-спектрометрии (с перекрыванием 70-80% последовательности альфа1-субъединицы при обработке химотрипсином и 50-60% при обработке трипсином) установлено, что из 15 цитозольных остатков цистеина Na,K-АТРазы при базовом глутатионилировании могут модифицироваться 12. Cys-423 никогда не был обнаружен в глутатионилированном виде. Инкубация Na,K-ATPазы из солевых желез утки со смесью восстановленный/окисленный глутатион (1,7 мМ/170 мкМ) приводит к полному ингибированию активности фермента. При этом увеличивается связывание глутатиона с остатками Cys-454 -458, -459 и -244 его альфа-субъединицы. Сравнение набора остатков цистеина, подвергающихся глутатионилированию, и результаты моделирования связывания глутатиона и АТP с Na,K-АТРазой из почек свиньи, позволяют предполагать, что для ингибирования активности Na,K-ATPазы необходимо глутатионилирование остатков Cys452, -456 и -457 альфа1-субъединицы, которые соответствуют остаткам Cys-454 -458 и -459 альфа1-субъединицы фермента из солевых желез утки, почек кролика и сердца крысы.
2 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Неклассические функции Na,K-АТФазы: регуляция инициации сигнальных путей, индуцируемых связыванием кардиотонических стероидов
Результаты этапа: С использованием очищенной и меченой флуоресцеинизотиоцианатом Na,K-АТРазы исследовано связывание с этим ферментом белка с мелиттин-подобными детерминантами с молекулярной массой 70 кДа и белка теплового шока HSP70. Каждый из белков образует комплексы с Na,K-АТРазой, что приводит к существенному увеличению флуоресценции меченого фермента. Образование комплексов белков с Na,K-АТРазой подтверждено перекрестной иммунопреципитацией с использованием антител против альфа1-субъединицы Na,K-АТРазы и антител против белков-партнеров с выявлением в иммунопреципитате второго белка комплекса. Методом иммунопреципитации показано, что связывание белка теплового шока HSP70 снижает общее количество белка с мелиттин-подобными детерминантами, связанного с Na,K-АТРазой, и наоборот. Эксперименты по связыванию белков-партнеров проведены с использованием Na,K-АТРазы, альфа-субъединица которой была глутатионилирована "базово", то есть со степенью глутатионилирования, которая характерна для нее после выделения. Эксперименты проводились в условиях защиты SH-групп цистеинов 454, 458 и 459, глутатионилирование которых приводит к ингибированию активности. Методом масс-спектрометрии установлено, что при базовом глутатионилировании глутатион связывают остатки цистеинов альфа1-субъединицы 206, 601 и 700. После проведения дополнительного глутатионилирования альфа1-субъединицы окисленным глутатионом in vitro в присутствии АDP удалось увеличить степень глутатионилирования альфа1-субъединицы за счет связывания глутатиона с остатками цистеинов 244, 338, 513 и 551. Уровень флуоресценции дополнительно глутатионилированной. Na,K-АТРазы при связывании белка с мелиттин-подобными детерминантами и HSP70 увеличивался, однако константы связывания для обеих белков изменялись незначительно. Эксперименты с перекрестной иммунопреципитацией показали, что как для базово глутатионилированной Na,K-АТРазы, так и для дополнительно глутатионилированного фермента наблюдается конкуренция между связыванием HSP70 и белком с мелиттин-подобными детерминантами. Проведено сравнение связывания двух стероидов:кардиостероида уабаина и буфадиенолида маринобуфагенина с базово глутатионилированной Na,K-АТРазой методом изотермической калориметрии титрования (ITC) и установлено, что природа связывания этих кардиостероидов различна: связывание уабаина экзотермическая реакция, связывание маринобуфагенина эндэргоническая реакция. Уабаин связывается с одним типом центров со стехиометрией 1 моль/мольфермента, константа связывания уабаина с альфа1-содержащей Na,K-АТРазой составляет 0,5 мкМ. Маринобуфагенин связывается с двумя типами центров с константами диссоциации 0,5 мкМ и 4 мкМ и стехиметрией 1моль/1 моль(первый центр), и стехиометрией 4 моль/ моль фермента (второй тип центров связывания). Дополнительное глутатионилирование альфа1-субъединицы фермента не меняет параметры связывания стероидов, но связывание уабаина с глутатионилированой Na,K-АТРазой увеличивает связывание с ней белка с мелиттин-подобными детерминантами. Эксперименты по связыванию адениновых нуклеотидов, проведенные методом ITC, показали, что появление гамма-фосфата (АТР) не влияет на сродство субстрата к ферменту, но связывание АТР по сравнению с ADP) вызывает существенный конформационный переход. В то же время появление бета-фосфата существенно увеличивает сродство к нуклеотиду, не влияя на конформацию фермента.
3 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Неклассические функции Na,K-АТФазы: регуляция инициации сигнальных путей, индуцируемых связыванием кардиотонических стероидов
Результаты этапа: Проведено сравнительное исследование взаимодействия двух кардиотонических стероидов (КТС) - уабаина и маринобуфагенина c Na,K-АТРазой. Оба КТС являются необратимыми ингибиторами при действии на фермент в конформации E2-P, и обратимыми, если они связываются с ним в состоянии равновесия E1-E2. Зависимость активности фермента от концентрации уабаина и маринобуфагенина описывается сигмоидальной кривой c различной величиной коэффициентома Хилла, что свидетельствует о разнице во взаимодействии между мономерами в олигомерных комплексах Na,K-АТРазы. Величина I50 для обоих КТС близка. Методом ITC путем титровании маринобуфагенином фермента со связанным уабаином показано, что оба КТС связываются с одним центром. С использованием ITC определены константы диссоциации для комплекса Na,K-АТРазы с АМР, АDР и АТР. Сравнение параметров связывания этих нуклеотидов в среде без Мg показывает, что Kд для комплекса фермент-АМР в 10 раз ниже, чем для комплекса фермента с АDР и АТР. Это свидетельствует, что бета-фосфат молекулы АТР отвечает за обеспечение высокого сродства к ферменту. Связывание АТР по сравнению с АDP не влияет на сродство к Na,K-АТазе, но вызывает существенный конформационный переход. В отсутствие ионов Мg предотвращается переход из конформации E1 в E2, что по ранее существующим представлениям ответственно за изменение положения отдельных субдоменов в цитоплазматической части белка. Построена модель, согласно которой именно связывание АТФ с ферментом, а не фосфорилирование аспарагиновой кислоты активного центра и переход Е1-Е2, создает “закрытую” конформацию cо сближением нуклеотид-связывающего и фосфорилируемого домена. 3. Методом ITC проведено сравнение связывания уабаина и маринобуфагенина с конформациями E1Na, E1NaATP и E2-P Na,K-АТРазы. При переходе в этом конформационном ряду сродство маринобуфагенина к участку связывания изменяется незначительно, а для уабаина - в 120 раз. 4. Связывание уабаина и маринобуфагенина с E1Na и E1NaATP конформациями Na,K-АТРазы является энтальпийно выходным процессом. Связывание уабаина с E2-P конформацией Na,K-АТРазы также энтальпийно выгодно, а вот связывание маринобуфагенина этой конформацией - энтропийно выгодный процесс, что свидетельствует об изменении характера взаимодействия двух КТС с одной и той же конформацией фермента. Построена молекулярная модель, описывающая взаимодействие уабаина и маринобуфагенина со связывающим центром Na,K-АТРазы. В соответствии с ней маринобуфагенин погружается в участок связывания, расположенный между трансмембранными фрагментами альфа-субъединицы Na,K-АТРазы, не так глубоко, как уабаин (примерно на 6 А ближе к поверхности мембраны.) При этом большая часть водородных связей, характерных для взаимодействия уабаина с аминокислотами связывающего центра, разрушается, но при связывании маринобуфагенина возникают дополнительные гидрофобные взаимодействия КТС с аминокислотами связывающего центра. 5. Методом флуоресцентной спектроскопии с использованием меток, прочно взаимодействующих с нуклеотид-связывающим доменом альфа-субъединицы Na,K-АТРазы (5-иодацетамидфлуоресцеин и флуоресцеиниззотиоцианат) установлено, что связывание уабаина и маринобуфагенина обеспечивает создание различных конформаций фермента. 6. С использованием антител на глутатион в составе белков (-SSG) установлено, что альфа1-субъединица Na,K-АТФазы выделяется из трех видов тканей животных (почки и сердце млекопитающих, солевые железы птиц) уже в глутатионилированном состоянии, однако инкубация фермента с окисленным гдутатионом приводит к дополнительному включению глутатиона в альфа1-субъединицу. Методом масс-спектрометрии показано, что в альфа-субъединице глутатионилировано 13 из 15 SH-групп, экспонированных в цитозоль. Окисленный глутатион дополнительно глутатионилирует 3 SH-группы (Cys 455, 456 и 458), расположенные вблизи активного центра фермента, что полностью подавляет ферментативную активность. АТР, ADP и АМP защищают фермент от инактивации окисленным глутатионом, сродство к ферменту снижается в этом ряду. Метод ITC показал, что взаимодействиее АDP и АМР с Na,K-ATPазой являются энтальпийно выгодными процессами. Глутатионилирование фермента окисленным глутатионом полностью предотвращает связывание АDP с Na,K-ATPазой Удаление глутатиона с SH-групп субъединицы зависит предсуществующего и неконтролируемого в процессе выделения глутатионилирования различных остатков цистеина альфа1-субъединицы фермента. Иногда удавалось полностью снять глутатион с альфа1-субъединицы ферментативно с использованием глутатионредуктазы и глутаредоксина. В некоторых случаях это приводило к устранению 30-40% связанного глутатиона, что сопровождалось повышением активности фермента не более, чем на 30%. Попытки снятия глутатиона с использованием химических восстановителей - дитиотреитола, меркаптоэтанола и TCEP (трис(2-карбоксиметил)-фосфингидрохлорида) привели к снятию глутатиона с альфа-субъединицы максимально на 30-40%, наилучший эффект наблюдался в среде с TCEP. Полное снятие глутатиона со всех 13 SH-групп наблюдали только в присутствии TCEP среде, вызывающей полную денатурацию (2 М мочевина, 2% додецилсульфата натрия). Исследовано связывание уабаина с глутатионилированным базово и деглутатионилированным под действием дитиотреитола фермента. Даже умеренное деглутатионилирование альфа-субъединицы под действием дитиотреитола приводит к 10-кратному снижению сродства Na,K-АТРазы к уабаину. Это означает, что есть непосредственная связь между спепенью окислительного стресса, который приводит к усилению глутатионилирования фермента, и возможностью модификации ответа клетки на один из КТС - уабаин. Связывание с Na,K-АТРазой фракции белков с мелиттин-подобными детерминантами, в которой присутствуют три белка (белок с WD-40 повторами, активатор фосфолипазы А2 и HSP 70), существенно возрастает после взаимодействия с ферментом уабаина. Это подтверждено для HSP-70, показано, что существует конкуренция между фракцией мелиттин-подобных белков и HSP 70 за связывание с Na,K-АТРазой. В соответствии с полученными данными представлена схема регуляции сигнальных каскадов через Na,K-АТРазу: связывание уабаина с ферментом зависит от уровня глутатионилирования альфа1-субъединицы Na,K-АТРазы, то есть, от выраженности окислительного стресса. Уабаин и маринобуфагенин связываются с ферментом с различным сродством: связывание уабаина существено различается в зависимости от конформации фермента, связывание маринобуфагенина происходит практически с одинаковым сродством в разных конформациях. Связывание c Na,K-АТРазой белков-партнеров зависит от связывания с ферментом КТС, причем эта зависимость характерна не только для белков-участников сигнальных каскадов, но и для других белков, например, HSP-70.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".