Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибовНИР

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа: В 2014 году изучены образцы, собранные в летние сезоны 2013-2014 годов в Московской, Владимирской, Костромской, Астраханской, Рязанской, Ленинградской областях, Краснодарском крае, респ. Татарстан. Ведется работа по анализу образцов, собранных в Ростовской области и на Северном Кавказе. Исследованы образцы листьев Паслена красного, собранного на территории МГУ в Москве. Диагностика с помощью ПЦР-анализа показала присутствие во всех пробах мелкоспоровых видов Alternaria; A. solani был отмечен в Краснодарском крае, Астраханской и Московской областях, A. infectoria – только в Костромской области. В 2014 году впервые были выделены в чистую культуру штаммы, поражающие клубни картофеля. Исследовано влияние на радиальный рост колонии P. infestans и образование ооспор препаратов, используемых при возделывании картофеля, но не зарегистрированных и не используемых против фитофтороза: фунгицидов Максим (действующее вещество флудиоксонил) и Скор (дифеноконазол), инсектицидов Актара (тиаметоксам) и Танрек (имидаклоприд), гербицида Зенкор (метрибузин), а также нового фунгицида Зерокс (коллоидное серебро). Дифеноконазол, тиаметоксам, имидаклоприд и метрибузин не оказывали статистически достоверного влияния на радиальный рост колонии P. infestans на питательной среде. Флудиоксонил и коллоидное серебро статистически достоверно тормозили развитие мицелия P. infestans при их концентрации в среде более 10 мг/л. Статистически достоверное снижение образования ооспор в питательной среде вызывали все исследованные пестициды. Слабый эффект отмечен только у тиаметоксама. Влияние имидаклоприда, флудиоксонила, дифеноконазола и коллоидного серебра отмечено при концентрации в среде более 1 мг/л. Сильное снижение образования ооспор отмечено в присутствии имидаклоприда, который, однако, не оказывал влияния на рост колонии даже в высокой концентрации (100 мг/л). Исследование влияние фунгицида Скор на образование ооспор в листьях картофеля сортов Бриз и Вектар белорусский показало статистически достоверное и зависящее от дозы дифеноконазола подавление ооспорообразования. Все собранные изоляты Rhizoctonia solani принадлежали к 3 группе вегетативной несовместимости. Исследование устойчивости к фунгицидам (на устойчивость к каждому фунгициду проверено по 15 изолятов) показало, что все исследованные изоляты были чувствительны к фунгицидам Зерокс и Максим (ЕС50 менее 1 ррм). К фунгициду Престиж был выявлен один высокоустойчивый изолят (ЕС50 более 100 ррм), в то время как все остальные исследованные штаммы были чувствительны (ЕС50 менее 1 ррм). Большинство исследованных изолятов были высокоустойчивы к препарату Квадрис (у 12 из 15 исследованных изолятов показатель ЕС50 более 50 ррм). К настоящему времени собрана коллекция грибов – возбудителей болезней картофеля, томата, диких пасленовых, состоящая из следующих изолятов: Phytophthora infestans (119 изолятов), Colletotrichum coccodes (46), Helminthosporium solani (157), Fusarium solani (18), Alternaria alternata (187), Alternaria solani (42), Dorathomyces sp.(5), Rhizoctonia solani (35), Botritys cinerea (4), Sclerotinia sclerotiorum (1). Разработаны ПЦР-праймеры и наборы для Real-time ПЦР для идентификации Phytophthora ramorum и P. citricola. Вариант для Real-time ПЦР позволяет выявлять этих патогенов одновременно, в одной пробирке. Кроме того, опробированы на российских изолятах из разных регионов тест-системы для ПЦР, созданные за рубежом, которые включают праймеры для диагностики Colletotrichum coccodes и Helminthosporium solani. Результаты эксперимента показали, что изученные импортные тест-системы вполне пригодны для анализа российских штаммов. Ведется анализ микобиоты листьев картофеля и томата с помощью ПЦР, клонирования в E.coli и секвенирования (ITS регион ядерной ДНК). В результате этой технологии можно выявлять видовой состав грибов из фиксированного материала, без выделения штаммов в чистую культуру. У изолятов Alternaria solani, A. infectoria и группы мелкоспоровых видов, выделенных с картофеля и томата, исследована протеиназная активность. Показано, что как общая активность, так и субтилизиновая и трипсиноподобная активности в отдельности, выше у штаммов, выделенных с томата, чем у «картофельных» изолятов.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Экология, биоразнообразие, генетика и молекулярные методы мониторинга и идентификации фитопатогенных грибов
Результаты этапа: 1. Изучение видового состава, биологических особенностей и внутривидового разнообразия грибов - возбудителей заболеваний картофеля, томата и диких пасленовых. Проведена работа по изучению патогенности и агрессивности штаммов Alternaria alternata из разных регионов России к сортам картофеля и томата. В работе использовали сорта картофеля разных групп спелости российской и белорусской селекции: ранние Зорачка и Лилея белорусская, среднеранние Бриз, Манифест, Романо, Невский, среднеспелые Волат, Лад, Скарб и Янка, среднепоздние Вектар Белорусский, Журавинка и Рагнеда (всего 13 сортов), а также коммерческие сорта крупноплодного томата Дубрава, Томск, Ла-Ла-Фам, Верлиока и Бычье сердце. Все исследованные изоляты, выделенные с листьев картофеля и томата, плодов томата, клубней картофеля смогли заразить листья картофеля и томата. В то же время наблюдались существенные различия в вирулентности изолятов в отношении листьев разных сортов картофеля и томата. Так, все изучаемые изоляты и взятый для контроля штамм A. solani смогли заразить сорта картофеля Невский, Лад, Волат, Бриз, Зорачка. Наиболее устойчивыми оказались сорта Лилея белорусская и Янка (поразились только 1 изолятом) и Рагнеда (поразилась 2 изолятами). Интересно, что эти сорта, а также Романо и Журавинка, не поразились взятым для контроля изолятом A. solani. Ни один из исследованных изолятов не показал себя вирулентным в отношении всех исследуемых сортов картофеля. Наибольшей вирулентностью отличались 2 изолята, выделенные из клубней картофеля (KPT 1 и KPT 4) , и один - из листьев томата METL 5, которые смогли заразить листья 10-11 из 13 исследованных сортов. Наименьшей вирулентностью отличался штамм, выделенный из пораженного плода томата (MTF 7), заразивший листья 7 сортов. Контрольный изолят A. solani (PPL 31) не показал высокой вирулентности, заразив листья 8 из 13 сортов картофеля. Исследование на листьях томата показало, что только сорт Дубрава поразился всеми исследуемыми изолятами, сорта Бычье сердце и Верлиока поразились только одним из трех исследованных штаммов A. alternata и контрольным A. solani. Листья всех исследуемых сортов смог заразить только изолят A. solani. Изоляты A. alternata, выделенные с плода томата (MTF 7) и METL 5 с листа томата заразили листья 4 сортов, а изолят METL 12 - листья только 1 сорта. В работе изучали только один компонент агрессивности - диаметр некроза на зараженном листе. Исследования показали, что наиболее агрессивными в отношении листьев картофеля разных сортов были штаммы, выделенные из клубня картофеля (KPT 1 и KPT 4) и METL 5 из листа томата (усредненный по заражению всех сортов диаметр некроза 8,9-10,8 мм). Эти же штаммы были вирулентны в отношении максимального числа сортов картофеля (поражали листья 10-11 сортов). Изоляты METL 5 и KPT 4 вызвали значительные некрозы (диаметром по 20 мм) на листьях сорта Рагнеда, который не поразился другими изолятами, включая A. solani. Изолят KPT 4 был единственным, успешно заразившим сорт Лилея белорусская, а KPT 1 - сорт Янка. Сильные отличия в диаметрах некрозов отмечены и при заражении сортов томата. Штамм METL 12 смог успешно заразить листья сорта Дубрава, но не заразил остальные сорта. Штамм METL 5 вызвал сильное поражение у листьев сортов Дубрава и Бычье сердце (диаметры поражения 18-20мм), а штамм A. solani сильно поразил сорт Дубрава (диаметр - 35 мм). Проведенная работа показала наличие внутривидовых различий в вирулентности и агрессивности у A. alternata в отношении листьев разных сортов картофеля. Некоторые изоляты успешно заражали сорта, не поражаемые другими изолятами, что может свидетельствовать в пользу наличия генов специфической устойчивости к A. alternata у сортов картофеля и томата. Для изучения секреции сериновых протеиназ были выбраны 2 изолята, выделенные с листьев томата и сильно различающиеся по вирулентности и агрессивности в отношении как листьев картофеля, так и томата - METL 12 и METL 5. Результаты проведенного исследования показали, что динамика секреции сериновых протеиназ была схожей для обоих штаммов: резкое повышение активности с 5 до 10 суток роста и такой же резкий спад к 18 суткам. У обоих изолятов максимальная активность секретируемых протеиназ наблюдалась на 10 сутки роста. Если активность трипсиноподобных и субтилизиноподобных протеиназ рассматривать по отдельности, то выявляется интересная закономерность. У более агрессивного штамма METL 5 на 10 сутки роста была значительно выше активность трипсиноподобной протеиназы, чем у менее агрессивного METL 12. В то же время у значительно менее патогенного штамма METL 12 существенно выше субтилизиноподобная активность. Для 23 изолятов вида Colletotrichum coccodes проведено секвенирование участка ядерных рибосомных генов (ITS). Анализ последовательностей нуклеотидов ITS выявил разделение выборки на 2 группы, причем во второй группе, представленной 3 изолятами, отмечены только изоляты, выделенные из импортированного из Германии семенного картофеля. Исследования устойчивости штаммов Colletotrichum coccodes к фунгицидам показали, что эффективным фунгицидным действием обладали дифеноконазол (препарат Скор) и коллоидное серебро (Зерокс). Хорошим фунгистатическим действием обладали азоксистробин (Квадрис), флудиоксонил (Максим), тиабендазол (Текто, Вист). Пенцикурон (Престиж) показал крайне низкую эффективность. К препарату Максим в лабораторных условиях довольно легко появлялись устойчивые формы грибов. 2. Создание коллекции чистых культур грибов, вызывающих поражения органов картофеля, томата и диких пасленовых в разных регионах Европейской части России. Проведена ревизия и очистка от сопутствующих микроорганизмов имеющейся коллекции грибов – возбудителей болезней картофеля, томата и диких пасленовых. Объем коллекции на сегодняшний день составляет 742 изолята, из них: Alternaria solani – 44 изолята, Alternaria alternata – 275 изолятов, Rhizoctonia solani – 36 изолятов, Colletotrichum coccodes – 46 изолятов, Helminthosporium solani – 215 изолятов, Phytophthora infestans – 126 изолятов. Созданы табличные базы данных результатов тестирования коллекционных изолятов. 3. Создание новых и опробирование существующих тест-систем для идентификации видов фитопатогенных грибов – патогенов картофеля, томата и диких пасленовых. В отчетном году изучали применимость для идентификации гриба Colletotrichum coccodes тест-системы, разработанной D. W. Cullen и A. K. Lees et al, 2002. Работа тест-системы была проверена с помощью компьютерного моделирования на имеющихся в базе Genbank сиквенсах, на чистых культурах коллекционных изолятов из разных регионов России и Европы, на искусственно зараженных органах картофеля и на смеси инокулюма с почвой. Во всех случаях анализ дал очень хорошие результаты. С помощью тест-системы протестированы 99 образцов фиксированных пораженных листьев картофеля, томата и диких пасленовых, собранных в Ростовской, Московской областях, г. Москва и в Ставропольском крае. Присутствие Colletotrichum coccodes выявлено в листьях томата из Ростовской области и Ставропольского края, в листьях картофеля из Московской области и Северной Осетии, и в листьях диких пасленовых из Москвы.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".