ИСТИНА

Оксидаза типа bd - терминальный дыхательный комплекс электрон-транспортных цепей многих прокариотических организмов, который окисляет хинол сопряженно с восстановлением кислорода до воды. Планируется исследовать роль фермента при окислительном и нитрозильном стрессе, в частности, изучить взаимодействие цитохрома bd с пероксинитритом. В качестве объекта исследования предполагается использовать цитохромы bd из Escherichia coli. Ожидаемые результаты позволят понять, как благодаря оксидазам этого типа бактерии, в особенности патогенные, запасают энергию при недостатке кислорода и других неблагоприятных условиях, противостоят нитрозативному и оксидативному стрессу, успешно инфицируя клетку-хозяина. Работу предполагается выполнять с использованием различных методов спектроскопии и амперометрии с временным разрешением.

A bd-type oxidase is a terminal complex of the respiratory electron transport chains of many prokaryotic organisms which oxidizes quinol coupled to reduction of oxygen to water. It is planned to investigate the role of the enzyme in oxidative and nitrosyl stress, in particular, to study the interaction of cytochrome bd with peroxynitrite. As the object of the study, cytochromes bd from Escherichia coli will be used. Expected results will allow us to understand how this type of oxidases helps bacteria, in particular pathogenic, conserve energy at oxygen deficiency and other adverse conditions and resist oxidative and nitrosative stress successfully infecting a host cell. Work is expected to perform using different time-resolved spectroscopy and amperometry.

Планируется исследовать взаимодействие цитохрома bd-I Escherichia coli с пероксинитритом. Предстоит ответить на два основных вопроса: (I) Каков ингибирующий эффект пероксинитрита на цитохром bd-I в сравнении с цитохром с оксидазой? (II) Не может ли терминальная оксидаза типа bd утилизировать пероксинитрит, выступая таким образом в качестве детоксификатора этого токсичного соединения?

У коллектива имеется достаточный научный задел по предлагаемому проекту. Изучение терминальных оксидаз bd-типа мы начали с 1994 года. Среди методов и подходов следует упомянуть метод прямого определения сродства гема к кислороду, впервые примененный для гемопротеинов [1, 2], методы идентификации индивидуальных полос поглощения гемов с помощью фемтосекундной спектроскопии [3] и спектроэлектрохимического титрования [4], метод окисления трудноразрушаемого оксикомплекса цитохрома d липофильными акцепторами электронов [5], адаптацию «прямого» электрометрического метода для хинолоксидаз [6], модификацию и успешное применение метода наносекундной лазерной спектроскопии [7], используемого для изучения фотосистем I и II, для исследования терминальных дыхательных оксидаз [8], методика количественной регистрации основных каталитических интермедиатов терминальной оксидазы в стационарном состоянии с помощью абсорбционной спектроскопии остановленного потока [9], определение стехиометрии гемовых групп на молекулу фермента с использованием комбинации методов абсорбционной спектроскопии, КД и МКД [10], регистрация каталазной активности цитохрома bd с помощью метода амперометрии по приросту продукта реакции - молекулярного кислорода [11]. [1] I. Belevich et al, FEBS Lett. 579 (2005) 4567-4570. [2] I. Belevich, et al, Biochemistry 46 (2007) 11177-11184. [3] M.H. Vos, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 1554-1559. [4] D.A. Bloch, et al, Biochim. Biophys. Acta 1787 (2009) 1246–1253. [5] V.B. Borisov, et al, J. Inorg. Biochem. 103 (2009) 1185-1187. [6] V.B. Borisov, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 17320–17324. [7] D. Beal, et al, Rev. Sci. Instrum. 70 (1999) 202-207. [8] F. Rappaport, et al, Biochim. Biophys. Acta 1797 (2010) 1657–1664. [9] V.B. Borisov, et al, Biochim. Biophys. Acta 1807 (2011) 503–509. [10] A.M. Arutyunyan, et al, Biochim. Biophys. Acta 1817 (2012) 2087-2094. [11] V.B. Borisov, et al, FEBS Lett. 587 (2013) 2214-2218.

Пероксинитрит - высоко реакционноспособное токсическое соединение, которое образуется из NO и супероксида в качестве ответа иммунной системы млекопитающих на бактериальную инфекцию. Используя методы амперометрии и абсорбционной спектроскопии, исследовано взаимодействие изолированного солюбилизированного цитохрома bd-I из Escherichia coli с пероксинитритом. Обнаружено, что цитохром bd-I из E. coli, в отличие от цитохром с оксидазы, не инактивируется пероксинитритом. Наблюдаемое быстрое и обратимое ингибирование работы цитохрома bd-I после добавления пероксинитрита наступает не собственно из-за пероксинитрита, а благодаря NO, выделяющейся при его распаде. Также показано, что фермент, находящийся в реакции с кислородом и восстанавливающими субстратами (ТМФД с аскорбатом), способен метаболизировать пероксинитрит с кажущимся числом оборотов ~10 моль пероксинитрита*(моль фермента)-1*с-1. Таким образом, цитохром bd-I из E. coli может служить в качестве детоксификатора пероксинитрита, защищая бактериальную клетку от повреждающего действия этого токсичного соединения.