ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Комплексное использование современных методов световой, электронной и зондовой микроскопии позволит получить детальную информацию о взаимодействии клеток с уникальными, разрабатываемыми в рамках комплексного проекта микроструктурированными поверхностями, содержащими микропаттерны сложной формы и заданного состава, а также со спидроиновыми трехмерными скаффолдами, сформированными впервые в мире с применением фотоотверждающих технологий. Исследования будут проведены на культуральных линиях нейробластом SH-5Y, Neuro2A, IMR32, способных к дифференцировке, и на первичных эмбриональных нейробластах. Будет исследована экспрессия молекул NCAM на нейрональных клетках при их культивировании на спидроиновых субстратах, исследована роль NCAM в межклеточных взаимодействиях, а также во взаимодействии нейронов с поверхностью пленок и скаффолдов. Особое внимание будет уделено исследованию способности микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов поддерживать дифференцировку линий нейробластом и эмбриональных нейробластов и стимулировать образование межклеточных контактов нейронов. Оценка нейрогенной активности спидроиновых скаффолдов in vivo будет осуществлена с использованием модели черепно-мозговой травмы. Планируется исследование формирования глио-мезодермального рубца, изучение течения воспалительных процессов и восстановления функциональных связей между нейронами в зоне контузионного повреждения. Гистологические и иммуногистохимические данные позволят получить информацию, необходимую для анализа нейрогенеза, спраутинга аксонов и нейритов и неоваскуляризации, происходящих in vivo в зоне трансплантации скаффолдов.
Целью проекта является изучение влияния модификаций биоискусственных субстратов на рост, дифференцировку и образование нейронных сетей in vitro и in vivo. Для достижения цели будут решены следующие задачи: Создание модельных систем для исследования взаимодействия нейрональных клеток с двумерными структурированными пленками и с трехмерными скаффолдами. Изучение влияния механических свойств субстратов и присутствия в них регуляторных последовательностей на нейрогенез, морфологию нейрональных клеток и их клеточных органелл, экспрессию белковых маркеров. Выявление зависимости скорости миграции нейрональных клеток от структуры и биологических свойств субстратов. Исследование физико-химических свойств структурированных пленок и трехмерных спидроиновых скаффолдов. Исследование влияния наличия в двумерных субстратах паттернов с заданным составом и механическими свойствами на образование нейронных сетей и их распределение по поверхности двумерных субстратов. Выбор из созданных пленок и скаффолдов тех, которые обеспечивают максимальный нейрогенный эффект in vitro. Исследование в модельных системах in vivo регенеративной активности скаффолдов, обеспечивающих максимальный нейрогенный эффект in vitro. Будет изучена структура и механические характеристики спидроиновых двумерных структурированных пленок и трехмерных скаффолдов, немодифицированных и модифицированных введением регуляторных последовательностей GRGGL и RGDS. Будет изучено влияние модификаций на биосовместимость скаффолдов, на способность поддерживать адгезию, пролиферацию, миграцию и жизнеспособность нейрональных клеток. Будет исследовано влияние модификации спидроиновых скаффолдов на их нейрогенную способность, т.е. способность стимулировать и поддерживать рост и образование межклеточных контактов нейронов, а также дифференцировку линий нейробластом и эмбриональных нейробластов. Будет проведен анализ влияния модификаций скаффолдов на экспрессию молекул NCAM и роли NCAM во взаимодействии нейронов со скаффолдами. Будет проведено исследование связи механических свойств скаффолдов с их нейрогенной активностью. Будет проведен выбор скаффолдов, обеспечивающих максимальный нейрогенный эффект in vitro. На модели черепно-мозговой травмы будет оценено влияние трансплантации выбранных в экспериментах in vitro скаффолдов на нейрогенез, а именно на формирование глио-мезодермального рубца, течение воспалительных процессов и восстановление функциональных связей между нейронами в зоне контузионного повреждения. Будет проведен гистологический анализ приживаемости трансплантированных скаффолдов. Будет проведена оценка восстановления сенсомоторных функций, объема повреждения головного мозга и гистологических изменений в зоне повреждения и прилежащих тканях, включая кору, стриатум и гиппокамп. Будет проведена оценка защиты головного мозга от острого повреждения методами МРТ-сканирования головного мозга, а также с помощью неврологических шкал на различных этапах после введения скаффолдов. Все эти параметры будут сравнены для различных модификаций скаффолдов. Скаффолды, показавшие наилучшую нейропротекторную эффективность, будут проанализированы иммуногистохимически и гистологически для анализа нейрогенеза, спраутинга аксонов и нейритов и неоваскуляризации, происходящих in vivo в зоне трансплантации скаффолдов. Мы попытаемся показать, что модификация скаффолдов функциональными группами, обеспечивающими лучшую адгезию нейрональных клеток, позволяет получить выраженную нейропротекцию.
Коллектив имеет большой опыт выполнения фундаментальных и поисковых научно-исследовательских работ в области клеточной биологии и иммунологии, тканевой инженерии, биофизики. С 2008 года и по настоящее время участники коллектива проводят разработку и исследование биодеградируемых скаффолдов для тканевой инженерии и регенеративной медицины, а также для использования в качестве модельных систем при исследовании механизмов клеточной дифференцировки, клеточного цикла, миграции и межклеточных взаимодействий, и других процессов. В результате выполненных ранее исследований разработаны методики создания различных типов скаффолдов, характеризующихся биосовместимостью, биоразлагаемостью и обеспечивающих поверхность для адгезии, пролиферации и миграции клеток. Разработан дизайн экспериментов и отработаны модельные системы, позволяющие выполнять исследование структуры, механических свойств, биодеструкции и биосовместимости. В экспериментах in vitro было продемонстрировано, что полученные скаффолды стабильны как в нейтральных, так и в окисляющих условиях в экспериментальных системах in vitro, являются биосовместимыми: поддерживают адгезию, пролиферацию и жизнеспособность как иммортализованных, так и первичных культур клеток, участвующих в регенеративных процессах. Методами клеточной и молекулярной биологии показано, что разработанные биоискусственные субстраты способны модулировать фенотип и функциональную активность иммобилизованных на них клеток.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 30 октября 2017 г.-26 октября 2018 г. | Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo |
Результаты этапа: Целью первого этапа были подбор и модификация известных, а также разработка новых, экспериментальных модельных систем, направленных на решение задач проекта. Для проведения указанных работ в ФБГУ "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" были получены новые фотоотверждаемые метакрилированные производные нативного фиброина (FBMA) и матакрилированный вариант рекомбинантного белка 1F9 – аналога белка каркасной нити паутины пауков-кругопрядов. Важной особенностью для достижения целей проекта является то, что молекулы 1F9 содержат 18 повторов последовательности GRGGL, которая представляет собой лиганд для связывания с рецепторами нейронной клеточной адгезии и является сигнальной для развития нейрональных клеток. Переданные образцы были сформированы в виде структур разных форм, включая пленки, микропаттерны, маты и макропористые губки. Проведенные физико-химические и механические исследования показали, что полученные фотоотверждаемые структуры были выше по прочности, чем контрольные образцы, сформированные классическими методами, в 20 и более раз, в зависимости от типа скаффолда, а также обладали повышенной жесткостью. Методами атомно-силовой и световой микроскопии было продемонстрировано, что фотосшивка растворов FBMA и тонких пленок позволила получить двумерные и трехмерные скаффолды на основе 1F9 и FBMA с точно настраиваемой макро- и микромасштабной архитектурой. Таким образом можно получать скаффолды различных форм и характеристик, которые могут быть использованы для регенерации различных типов тканей. Поверхности всех полученных фотоотверждаемых конструкций поддерживают адгезию и пролиферацию клеток, способствуя сохранению их высокой жизнеспособности, что было продемонстрировано в экспериментах на мышиных фибробластах 3T3, кератиноцитах HaCaT, мышиных эмбриональных фибробластах, а также на других иммортализованных клеточных линиях и первичных культурах. При исследовании нейрогенной активности пленок повышенной жесткости наибольшее количество данных получено и включено в данный отчет для двумерных структур из FBMA. Так была исследована дифференцировка клеток нейробластомы линии SH-SY5Y. Применение современных методов световой микроскопии показало, что на субстратах из метакрилированного фиброина происходило увеличение длины нейритов клеток и повышение экспрессии маркеров нейрональной дифференцировки: MAP2, NeuN, NCAM и тубулина βIII. Представленные нами данные, а также результаты, полученные в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, свидетельствуют о том, что метакрилированный фиброин – биосовместимый и простой в технологическом отношении материал с усовершенствованными характеристиками, который может применяться для трансплантации нейральных клеток. Также были проведены исследования, направленные на изучение взаимодействия SH-SY5Y с биоискусственными поверхностями 1F9. Результаты этих исследований анализируются и будут подготовлены к публикации в 2019 году. За отчетный период были изучены краткосрочные и долговременные эффекты трансплантации фиброинсодержащих микрочастиц на последствия травматического повреждения головного мозга. Такое исследование проводилось для отработки модельных систем, необходимых для успешного выполнения запланированных на поздних этапах реализации проекта работ по изучению влияния разрабатываемых фототоверждаемых конструкций на восстановление повреждения сенсомоторной коры головного мозга крысы. Из полученных результатов также следует, что нативный фиброин оказывает плейотропное защитное действие, способствуя усилению регенерации нервной ткани, что приводит к функциональному восстановлению мозга. Все полученные на 1 этапе данные будут использованы для реализации следующего этапа научного проекта и выполнения комплексного проекта в целом. | ||
2 | 6 декабря 2018 г.-3 декабря 2019 г. | Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo |
Результаты этапа: В ходе выполнения работ второго этапа исследований в ФБГУ "ГосНИИГенетика" в рамках проекта «Микроструктурированные пленки и трехмерные скаффолды на основе рекомбинантных спидроинов для изучения дифференцировки, клеточного цикла и межклеточных взаимодействий нейрональных клеток» были получены фотоотверждаемые метакрилированные производные рекомбинантных аналогов белков каркасной нити паутины пауков-кругопрядов, в том числе 1F9 (rS1/9); 2Е12 (rS2/12) без регуляторных последовательностей; 2Е12-RGDS (rS2/12-RGDS) с последовательностью RGDS на C-конце; 2Е12-linker-RGDS (rS2/12-linker-RGDS) с последовательностью RGDS С-конце линкер SGGSGGSGGSGG. Ключевой особенностью для достижения целей проекта является присутствие в производных Е12 последовательности RGDS, взаимодействующей с интегринами, а в молекуле 1F9 наличие 18 повторов GRGGL, являющейся лигандом для NCAM. Из этих производных были получены 2D-пленки и 3D-скаффолды и микропаттерны. Для осуществления исследований на клеточных культурах были получены стекла, покрытые слоем метакрилированного фотоотвержденного белка. При этом структура покрытия обладала тем же микрорельефом и, в целом, повторяла структуру пленок. Показано, что исследуемые белки спонтанно формируют характерные пористые структуры нанометрового размера. Наличие такой наноструктуры должно способствовать газообмену, обмену продуктами метаболизма, влиять на механические свойства и рельеф поверхности и в комплексе улучшать показатели биосовместимости in vivo и in vitro. Были исследованы механические свойства полученных структур, их биодеградация. Полученные конструкции были переданы для дальнейших исследований в рамках проекта «Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo», в рамках которого было исследовано взаимодействие конструкций с клетками разных типов, в том числе с первичными культурами нейронов гиппокампа и коры мозга мыши, а также с нейрогенными клетками крысы. Было показано, что поверхности всех полученных фотоотверждаемых конструкций обладают прекрасными показателями цитосовместимости, превосходящими аналогичные показатели метакрилированного фиброина. Это было продемонстрировано в экспериментах на мышиных фибробластах 3T3, мышиных эмбриональных фибробластах, клетках нейробластомы линии SH-SY5Y и на первичных нейрональных клетках различного происхождения. Особый интерес представляют результаты взаимодействия первичных нейронов коры мозга мыши с исследуемыми субстратами. Субстраты на основе фиброина и его метакрилированных производных, поддерживающих рост и дифференцировку нейрогенных иммортализированных клеток SH-SY5Y, не обеспечивали высоких показателей роста первичных нейронов. Однако, все производные спидроинов, а в особенности 1F9 и 2Е12-linker-RGDS и их метакрилаты, обладали нейростимулирующей активностью, что проявлялось в увеличении длины нейритов и повышении экспрессии маркеров нейрональной дифференцировки: MAP2, NeuN, NCAM и β3-tubulin [Moysenovich A.M. et al. Akt and Src Mediate the Photocrosslinked Fibroin Induced Neural Differentiation" // NeuroReport (сдана в редакцию)]. Также высокая биосовместимость и регенеративная активность разработанных конструкций была продемонстрирована при оценке влияния полученных пленок на регенерацию кожи. Исследования in vivo были проведены в модели полнослойной раны кожи мыши. Использование пленок Ф-МЖ в качестве раневых покрытий способствовало ускорению заживления раны и более полному восстановлению структуры кожи по сравнению с контролем (применение марли). У животных в экспериментальной группе наблюдалось формирование волосяных фолликулов и сокращение площади рубца на 28 сутки [Котлярова М.С. и др., Фотоотверждаемые пленки на основе фиброина и желатина для регенерации кожных покровов // Вестник московского университета (сдана в редакцию)]. В сотрудничестве с исследователями из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина» Минздрава России в рамках проекта «Молекулярные механизмы индукции нейродифференцировки на микроструктурированных пленках и трехмерных скаффолдах из рекомбинантного спидроина» были получены данные о влиянии стрессовых факторов на показатели роста фибробластов мыши, культивируемых на субстратах из 1F9 и фиброина. Показано, что такие пленки способствуют активной клеточной пролиферации, а при наличии стрессовых факторов защищают от проявления признаков клеточного старения, таких как: увеличение площади клеток и их ядер, снижение показателей пролиферации, усиление апоптоза, снижение синтеза коллагена. Наиболее выраженный эффект поддержания параметров роста клеточной культуры как при высокой, так и при низкой концентрации глюкозы, предположительно, был обеспечен за счет физико-химических структурных и биологических особенностей поверхности пленок из белка спидроина. Кроме того, были получены данные о регенеративной активности спидроиновых частиц на генетически модифицированной репортерной линии мышей, у которых стволовые клетки и их потомство характеризуются экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP), находящегося под промотором нестина. Анализ срезов через 7 суток после моделирования фокальной ишемии выявил большее количество нестин-положительных клеток в области зубчатой фасции в группе животных, получивших инъекцию спидроина, по сравнению с группой, получавшей инъекции физиологического раствора. Анализ срезов головного мозга, приготовленных через 4 недели после индукции ишемии, выявил также большее количество нестин-положительных клеток в зубчатой фасции гиппокампа в группе животных, получивших спидроин. | ||
3 | 3 марта 2020 г.-28 февраля 2021 г. | Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo |
Результаты этапа: Хорошо известно существование ниш для размещения стволовых клеток в желудочково-субвентрикулярной зоне и субгранулярной зоне головного мозга взрослых. Эти зоны являются местами восстановления функций мозга после травм. Было показано, что биоинженерные каркасы, введенные в поврежденные локусы, поддерживают нейрогенез в области повреждения, что представляет собой стратегию лечения острой нейродегенерации. В данном исследовании мы исследовали нейропротекторную активность рекомбинантного аналога спидроина 1 rS1 / 9 Nephila clavipes после его введения в мозг, поврежденный ишемией. Мы использовали линию трансгенных репортерных мышей с нестин-зеленым флуоресцентным белком (GFP), у которых нервные стволовые клетки / клетки-предшественники легко визуализируются и количественно оцениваются по экспрессии GFP, чтобы определить изменения в зубчатой извилине (DG) после фокальной ишемии в префронтальной области. кора. Предметом исследования были изменения в пролиферации нервных стволовых / прогениторных клеток в течение первых недель после ишемии мозга, вызванной фототромбозом, и эффекты спидроина rS1 / 9 in vitro в первичных культурах нейронов крыс. Введение микрочастиц рекомбинантного белка rS1 / 9 в область ишемического повреждения префронтальной коры приводит к более высокой скорости пролиферации и увеличению выживаемости клеток-предшественников в DG гиппокампа, который функционирует как ниша стволовых клеток мозга, расположенных в удаленность от зоны травмы. rS1 / 9 также увеличивает уровни митохондриального зонда в клетках DG, что может сообщать либо об увеличенном количестве митохондрий и / или потенциале митохондриальной мембраны в клетках-предшественниках. По-видимому, стимуляция клеток-предшественников была вызвана сформированными биологически активными продуктами, возникающими в результате биодеградации rS1 / 9, которые также могут влиять на рост первичных кортикальных нейронов, их адгезию, рост нейритов и формирование нейронной сети. Высокая биологическая активность rS1 / 9 предполагает, что он является отличным материалом для терапевтического использования, направленного на повышение пластичности мозга за счет взаимодействия с нишами стволовых клеток. Вещества, образованные из rS1 / 9, также можно использовать для усиления первичной нейрозащиты, что приводит к снижению гибели клеток в области повреждения. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".