![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Эукариотическая клетка обладает огромным потенциалом быстро отвечать на внешние воздействия, такие как обработка лекарствами, цитокинами, факторами дифференцировки, роста и т.д. При этом происходит изменение набора работающих (экспрессируемых) генов, причем иногда этот набор кардинально меняется буквально в течение минут. В принципе, экспрессия может меняться как за счет изменения уровня мРНК, так и за счет изменения ее трансляционной активности. До недавнего времени изучать изменения экспрессии на полногеномном уровне было весьма затруднительно. Однако разработанный не так давно метод рибосомного профайлинга позволяет одновременно оценивать изменения как количества мРНК в клетке, так и их трансляционной активности в любой момент времени. Данный подход основан на глубоком секвенировании фрагментов мРНК, защищаемых рибосомой от разрезания рибонуклеазами. Параллельно проводят секвенирование тотальной мРНК. По изменению количества фрагментов мРНК, защищаемых рибосомой (футпринты), можно оценить плотность нахождения рибосом на данной конкретной мРНК и, как следствие, оценить изменение трансляционной активности после воздействия на клетку. Одновременно можно увидеть и изменение уровня мРНК. Этот метод позволяет изучать очень быстрые изменения в экспрессии генов в ответ на определенное воздействие в масштабе целого генома (транскриптома), исследовать развитие процесса во времени, что еще недавно было невозможно. После идентификации генов раннего ответа, регулируемых на пост-транскрипционном уровне, появляется возможность приступить к изучению механизмов их активации или подавления экспрессии. Таким образом, суть и новизна проекта состоят в том, что вслед за системным анализом экспрессии всех мРНК в ходе раннего ответа после различных воздействий будет проводиться исследование механизмов контроля экспрессии уже конкретных индивидуальных мРНК.
Проведены эксперименты с применением рибосомного профайлинга для изучения ответа клеток на ингибирование дыхательной цепи митохондрий. Обнаружена регуляция двух классов мРНК: мРНК, имеющие специализированные короткие рамки считывания в 5'НТО (uORF), стимулируются на трансляционном уровне, а мРНК, имеющие на 5'конце полиприримидиновый тракт (5'TOP) - специфически подавляются. Также получены результаты изменения экспрессии генов при обработке клетки интерфероном. Механизмы регуляции трансляции были изучены на некоторых модельных репортерных мРНК при трансфекции в клетки млекопитающих и в бесклеточной системе трансляции, охарактеризованы регуляторные элементы. Изучена роль определенных uORF при регуляции трансляции в ответ на инактивацию фактора инициации eIF2.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 20 мая 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Идентификация генов раннего ответа клеток млекопитающих на внешние воздействия и изучение механизмов регуляции их экспрессии. |
Результаты этапа: Экпериментально подтверждены пять новых случаев устойчивой трансляции мРНК при инактивации фактора инициации трансляции eIF2. С помощью производных природных мРНК и полностью искусственных синтетических конструкций сформулирован минимальный набор черт мРНК, необходимых для трансляционной регуляции при стрессе: мРНК в своей 5’ нетранслируемой области должна содержать одну открытую рамку считывания (uORF) длиной более 20 аминокислот, которой должна предшествовать неструктурированная область. Начались исследования трех необычных случаев регуляции для индивидуальных эукариотических мРНК: эффективная инициация трансляции uORF с неканонического инициаторного кодона, программируемый сдвиг рамки считывания с последующей абортивной терминацией трансляции, и трансляция длинной перекрывающейся рамки считывания, кодирующей функциональный белковый продукт массой около 30 кДа. Проведен эксперимент рибосомного профайлинга по изучению ответа клеток на обработку цитокином. Налажена система индуцируемой siRNA интерференции для изучения функции неканонических факторов инициации. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Идентификация генов раннего ответа клеток млекопитающих на внешние воздействия и изучение механизмов регуляции их экспрессии. |
Результаты этапа: | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Идентификация генов раннего ответа клеток млекопитающих на внешние воздействия и изучение механизмов регуляции их экспрессии. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".