ИСТИНА

Транскетолаза (ТК) катализирует взаимопревращение кето- и альдосахаров. Известно, что в процессе катализа первоначально кетосахар связывается в активном центре фермента с коферментом, тиаминдифосфатом (ТДФ), по второму углеродному атому тиазолового кольца. Тут же происходит отщепление фосфоальдегида (например, если субстрат-донор - пятиуглеродная кетоза, ксилулозо-5-фосфат, то отщепляется трехуглеродная альдоза – фосфоглицериновый альдегид (ФГА). При этом с ТДФ остается связанным гликолевый альдегид (ГА). Это все, что было известно о механизме транскетолазной реакции. Куда присоединяется субстрат-акцептор, не было известно. Мы предположили, что его первоначальное связывание происходит с аминогруппой пиримидинового кольца ТДФ, с образованием основания Шиффа. В этом случае восстановление основания Шиффа (мы это проводим с помощью цианборгидрида натрия (ЦБГ) приведет к образованию прочной ковалентной связи между субстратом и ТДФ, что позволит выделить это соединение и определить его свойства, в том числе молекулярную массу, а также, путем фрагментации молекулы, выяснить, с каким из двух колец ТДФ связался субстрат. Как оказалось, связывание субстрата-донора происходит и в отсутствие субстрата-акцептора. Пока молекулярную массу этого интермедиата мы определили приблизительно с использованием сефадекса G-15. Ранее нами было показано, что ТК может катализировать односубстратную реакцию, с одним субстратом-донором. Мы показали, что после быстрого отщепления ФГА происходит медленное отщепление оставшегося двууглеродного фрагмента, но при этом в среде совершенно не обнаруживается ГА, а обнаруживается эритрулоза, которая является продуктом конденсации двух молекул ГА. Чрезвычайно интересно понять, по какому механизму присоединяется вторая молекула субстрата-донора, дающая первую молекулу ГА, и где в это время находится первая молекула ГА, поскольку очевидно, что она связана с ТДФ до конденсации со второй молекулой.

Ранее было известно, что аминогруппа пиримидинового кольца кофермента (рис. 1) в транскетолазной реакции выполняет функцию донора-акцептора протона, участвуя в связывании субстрата-донора со вторым углеродным атомом тиазолового кольца ТДФ (рис. 1). Согласно нашему предположению, аминогруппа ТДФ является, кроме того, донором-акцептором альдозы / альдегидной группы. В транскетолазной реакции есть три альдегидных кандидата на взаимодействие с аминогруппой: субстрат-акцептор, первый продукт расщепления кетозы и интермедиат транскетолазной реакции – остаток гликольальдегида, образующегося в результате расщепления субстрата-донора (рис. 2). В процессе выполнения проекта нами были получены экспериментальные доказательства выдвинутого предположения – показано образование основания Шиффа между остатком гликольальдегида и аминогруппой пиримидинового кольца ТДФ в реакции, катализируемой транскетолазой.