ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Транскетолаза (ТК) катализирует взаимопревращение кето- и альдосахаров. Известно, что в процессе катализа первоначально кетосахар связывается в активном центре фермента с коферментом, тиаминдифосфатом (ТДФ), по второму углеродному атому тиазолового кольца. Тут же происходит отщепление фосфоальдегида (например, если субстрат-донор - пятиуглеродная кетоза, ксилулозо-5-фосфат, то отщепляется трехуглеродная альдоза – фосфоглицериновый альдегид (ФГА). При этом с ТДФ остается связанным гликолевый альдегид (ГА). Это все, что было известно о механизме транскетолазной реакции. Куда присоединяется субстрат-акцептор, не было известно. Мы предположили, что его первоначальное связывание происходит с аминогруппой пиримидинового кольца ТДФ, с образованием основания Шиффа. В этом случае восстановление основания Шиффа (мы это проводим с помощью цианборгидрида натрия (ЦБГ) приведет к образованию прочной ковалентной связи между субстратом и ТДФ, что позволит выделить это соединение и определить его свойства, в том числе молекулярную массу, а также, путем фрагментации молекулы, выяснить, с каким из двух колец ТДФ связался субстрат. Как оказалось, связывание субстрата-донора происходит и в отсутствие субстрата-акцептора. Пока молекулярную массу этого интермедиата мы определили приблизительно с использованием сефадекса G-15. Ранее нами было показано, что ТК может катализировать односубстратную реакцию, с одним субстратом-донором. Мы показали, что после быстрого отщепления ФГА происходит медленное отщепление оставшегося двууглеродного фрагмента, но при этом в среде совершенно не обнаруживается ГА, а обнаруживается эритрулоза, которая является продуктом конденсации двух молекул ГА. Чрезвычайно интересно понять, по какому механизму присоединяется вторая молекула субстрата-донора, дающая первую молекулу ГА, и где в это время находится первая молекула ГА, поскольку очевидно, что она связана с ТДФ до конденсации со второй молекулой.
Ранее было известно, что аминогруппа пиримидинового кольца кофермента (рис. 1) в транскетолазной реакции выполняет функцию донора-акцептора протона, участвуя в связывании субстрата-донора со вторым углеродным атомом тиазолового кольца ТДФ (рис. 1). Согласно нашему предположению, аминогруппа ТДФ является, кроме того, донором-акцептором альдозы / альдегидной группы. В транскетолазной реакции есть три альдегидных кандидата на взаимодействие с аминогруппой: субстрат-акцептор, первый продукт расщепления кетозы и интермедиат транскетолазной реакции – остаток гликольальдегида, образующегося в результате расщепления субстрата-донора (рис. 2). В процессе выполнения проекта нами были получены экспериментальные доказательства выдвинутого предположения – показано образование основания Шиффа между остатком гликольальдегида и аминогруппой пиримидинового кольца ТДФ в реакции, катализируемой транскетолазой.
МГУ имени М.В.Ломоносова | Координатор |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 28 марта 2013 г.-31 декабря 2014 г. | Тиаминовый катализ – сопряжение химических и механических воздействий на субстрат |
Результаты этапа: Основная работа по проекту в текущем году касалась проведения масс-спектрометрического анализа образцов, получаемых путем инкубации рибозо-5-фосфата (Р5Ф) с холотранскетолазой (холоТК) и их интерпретации. Показано, что основными продуктами превращения Р5Ф являются его производные с тиаминдифосфатом (ТДФ), связанные по С2 тиазолового кольца кофермента, и остаток гликольальдегида, образовавшего основание Шиффа с аминогруппой пиримидинового кольца кофермента (образование основания Шиффа между альдегидной группой Р5Ф и аминогруппой пиримидинового кольца кофермента пока остается под вопросом). Это хорошо согласуется с выдвинутым нами в Проекте предположением о том, что аминогруппа ТДФ выполняет функцию донора-акцептора альдегидной группы в транскетолазной реакции. Показано, что ТК способна, кроме основной трансферазной реакции с использованием субстрата-донора и субстрата-акцептора, катализировать также расщепление молекулы Р5Ф по его С2 - С3 связи. В качестве продуктов реакции образуются диоксиацетонфосфат и тетроза. Первый из них был нами идентифицирован и количественно определен энзиматически с использованием глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и НАДН. Природа тетрозы пока не известна. Можно лишь полагать, что она образуется путем конденсации двух молекул двууглеродного соединения (фрагмента), образующихся при расщеплении Р5Ф. Обнаруженное нами превращение Р5Ф с разрывом его С2 - С3 связи – это новая, не известная ранее реакция, катализируемая транскетолазой, и первый случай для ТК, а возможно и для всех ТДФ-зависимых ферментов, когда разрываемая С-С-связь субстрата не прилегает к его карбонильной группе. Показано, что аскорбиновая кислота (физиологический редуцирующий агент) способна, в присутствии субстрата, ингибировать ТК, что может быть одним из возможных механизмов регуляции данного фермента. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Тиаминовый катализ – сопряжение химических и механических воздействий на субстрат |
Результаты этапа: Восстановленный НАДФ в присутствии субстрата-акцептора ингибирует транскетолазу. Причиной является потеря коферментом способности выполнять свою каталитическую функцию. Ингибирование обратимо при простом разведении ферментного раствора, а при добавлении в него избытка тиаминдифосфата активность восстанавливается. Обратимость ингибирования, а также тот факт, что восстановленный НАДФ является естественным физиологическим компонентом живой клетки, указывают на его возможную регуляторную функцию. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".