ИСТИНА

В соответствии с общим планом работ по проекту, направленному на создание и характеристику малотоксичных разобщителей пептидной природы на основе модификации известного каналоформера грамицидина А, нами синтезированы и очищены пептиды – аналоги грамицидина A, несущие на N-конце заряженные аминокислоты, лизин и глутамат. Исследована каналоформерная активность лизин- и глутамат-замещенных аналогов грамицидина по измерению тока одиночных каналов на плоской бислойной липидной мембране. Изучена рН-зависимость каналоформерной активности лизин и глутамат-замещенных аналогов грамицидина, несущих протонируемые группы, на уровне интегральных токов. На основании различий в поведении пептидов в случае симметричного или асимметричного добавления пептидов в ячейку с плоской БЛМ, сделано заключение о том, что калиевые каналы, образуемые Lys-1-gA при щелочных рН, имеют каноническую структуру димера голова-к-голове, тогда как каналы, образуемые Lys-3-gA, имеют структуру двойной спирали. Обнаружена индукция неселективной проводимости мембран липосом под действием лизин-замещенных аналогов грамицидина А. Это было показано по вытеканию из липосом двух различных флуоресцентных маркёров: сульфородамина В и карбоксифлуоресцеина. Эффективность индукции пептидами больших неселективных пор зависела от положения лизинового остатка в аминокислотной последовательности и была максимальной для [Lys3]gA. Способность лизин-замещенных производных gA к неселективному порообразованию была продемонстрирована также с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) по высвобождению из липосом другого флуоресцирующего красителя, четырежды сульфированного алюмофталоцианина. Одним из важнейших результатов проекта явилось обнаружение разобщающей активности глутамат-замещенных производных грамицидина А в системе изолированных митохондрий с помощью измерения флуоресценции потенциал-зависимого красителя сафранина О. Установлено, что аналог грамицидина А, содержащий остаток глутамата в 1-ом положении, вызывает снижение мембранного потенциала митохондрий с наибольшей (из изученного ряда пептидов) эффективностью. Изучено влияние пептидов-аналогов грамицидина А с заменой аминокислотных остатков на N-конце на скорость дыхания митохондрий, выделенных из печени крыс. Показано, что все исследованные аналоги, а именно [Glu1]gA, [Glu2]gA, [Glu3]gA, [Glu5]gA и [Asp1]gA, вызывали увеличение скорости дыхания, т.е. обладали разобщающей активностью. Максимальное ускорение дыхания, близкое к таковому в присутствии грамицидина А, наблюдалось под действием [Glu1]gA. Сравнительное исследование протонофорной и разобщающей активности различных пептидов было проведено соответственно, на липосомах, нагруженных пиранином, и выделенных митохондриях. Среди набора замещенных по N-концу аналогов грамицидина А, пептид с заменой валина-1 на глутамат ([Glu1]gA) был наиболее эффективным переносчиком протонов как в липосомах, так и в изолированных митохондриях. С помощью измерения флуоресценции потенциал-чувствительного красителя тетраметилродамина этилового эфира на флуоресцентном микроскопе изучено разобщающее действие пептидов на мембраны митохондрий в первичной культуре клеток почки. Деполяризующая активность [Glu1]gA на митохондриях в культуре клеток наблюдалась при концентрациях на порядок более низких, чем в случае gA. Полученные на первом этапе проекта данные о существенно сниженной способности [Glu1]gA к индукции токов калия указывали на возможность низкой токсичности этого соединения. Эти ожидания оправдались. Действительно, [Glu1]gA в разобщающих концентрациях не оказывал влияния на морфологию клеток и был нетоксичен согласно MTT-тесту, в отличие от gA, проявлявшего высокую токсичность. Кроме того, в отличие от лизин-замещенных производных, глутамат-замещенные аналоги gA практически не обладали гемолитической активностью. В связи с защитной ролью мягкого разобщения, [Glu1]gA и другие протон-проводящие аналоги gA могут рассматриваться в качестве прототипов перспективных терапевтических агентов.