| 1 |
1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Нейрональный кальциевый сенсор 1 (NCS1) в нормальной и патологической фоторецепторных системах |
| Результаты этапа: В 2015 году на транскриптомном и протеомном уровнях охарактеризована структура NCS1 двух видов позвоночных животных, Bos taurus (бык) и Oryctolagus cuniculus (кролик). Методами PCR и PCR-RACE впервые полностью разрешена последовательность мРНК NCS1 из сетчатки, а также мозговой ткани указанных видов. Показано, что, несмотря на различия в последовательностях полученных транскриптов, соответствующие продукты трансляции будут совпадать и являются идентичными последовательности NCS1 человека. В то же время, масс-спектрометрический анализ белковых препаратов NCS1, выделенных из мозговой ткани быка, выявил наличие пептидных фрагментов, часть последовательности которых не относится к канонической структуре белка. Биоинформатический анализ геномной ДНК различных видов позвоночных животных показал, что изоформы NCS1, содержащие указанные пептиды, могут образовываться в результате альтернативного сплайсинга. С применением иммуногистохимических методов определена локализация NCS1 в сетчатке быка. Показано, что белок присутствует в слое ганглиозных клеток, наружном и внутреннем плексиформных слоях, а также в слое фоторецепторов. Впервые продемонстрировано присутствие NCS1 в наружных сегментах фоторецепторных клеток, что может указывать на наличие у этого белка функции в рамках каскада фототрансдукции. Завершена часть экспериментов по выяснению механизма мембранной ассоциации NCS1. Методом равновесного ультрацентрифугирования показано, что NCS1 способен взаимодействовать с фоторецепторными мембранами, причем заметное связывание наблюдается не только в присутствии, но и в отсутствие Ca2+. Сравнительный анализ взаимодействия NCS1 с фоторецепторными мембранами и мембранами гиппокампа быка показал, что в последнем случае снижение аффинности NCS1 к мембранам в отсутствие катиона более выражено, что говорит о вкладе фосфолипидного состава бислоя в связывание бескальциевой формы белка. Проведены исследования роли N-концевых остатков лизина в 3-м, 7-м и 9-м положениях полипептидной цепи NCS1 в механизме мембранной ассоциации белка. Показано, что замена всех этих остатков снижает сродство NCS1 к обоим типам мембран в ряду WT>К9Е>K7E>K3E, однако Са2+-зависимость связывания в случае мутантов K7E и K9E остается неизменной. В то же время, обращение заряда в третьем положении полипептидной цепи NCS1 существенно подавляет его связывание с фоторецепторными мембранами в отсутствие Са2+, что говорит о ключевой роли K3 в мембранной ассоциации бескальциевой формы белка. Впервые продемонстрирована способность NCS1 взаимодействовать с интегральным белком мембранных рафт-струкутр кавеолином-1. Получен синтетический пептид, соответствующий фрагменту F81-R101 цитоплазматического домена этого белка. Охарактеризованы термодинамические параметры, стехиометрия, и константы диссоциации (Kd) комплексов NCS1 с F81-R101. Показано, что сродство бескальциевой формы NCS1 к фрагменту кавеолина-1 является более выраженным (Kd=0,359 мкМ), чем в случае Са2+-связанного белка (Kd=0,998 мкМ). Выявлен и идентифицирован ряд потенциальных мишеней NCS1 в сетчатке, среди которых D-субъединица H+-АТФазы V-типа, рибосомальный белок S13, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и рековерин (Са2+-независимое взаимодействие), а также родопсинкиназа (Са2+-зависимое взаимодействие). |
| 2 |
1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Нейрональный кальциевый сенсор 1 (NCS1) в нормальной и патологической фоторецепторных системах |
| Результаты этапа: В 2016 году получен ряд новых данных, касающихся механизмов мембранной ассоциации и специфики регуляторной активности фоторецепторного NCS1. Сконструированы, выделены и структурно охарактеризованы новые N-концевые мутанты NCS1, с использованием которых подтверждено, что эффективность взаимодействия белка с фоторецепторными мембранами существенно снижается в случае инверсии положительного заряда аминокислотных остатков 3, 7 и 9 его полипептидной цепи. В частности, одновременная замена остатков лизина в этих положениях на остатки глутаминовой кислоты практически полностью блокирует указанное взаимодействие. При этом сродство NCS1 к индивидуальным фосфолипидам мембраны является чувствительным к величине и положению их отрицательного заряда. Так, максимальное связывание обнаружено в случае монослоя, содержащего PtdIns(4)P и PtdIns(4,5)P2, а замена N-концевых остатков лизина белка подавляет это связывание. Полученные данные впервые указывают на ключевую роль электростатических взаимодействий между N-концевыми остатками NCS1 и заряженными группами фосфолипидов, что может обуславливать селективность мембранной локализации и, как следствие, специфику функционирования белка. Впервые продемонстрировано, что взаимодействие NCS1 с цитоплазматичесикм доменом интегрального мембранного белка кавеолина-1 необходимо не только для позиционирования NCS1 в составе мембранных рафт-структур, но и имеет регуляторный характер, поскольку полностью подавляет его активность в отсутствие Са2+. В дополнение к найденным ранее Са2+-независимым потенциальным мишеням фоторецепторного NCS1, идентифицирован ряд белков сетчатки, способных связываться с ним Са2+-зависимым образом, среди которых аррестин, реиноидсвязывающий белок IRBP и тубулин бета 2А. Установлено, что среди 13-ти выявленных потенциальных мишеней только рековерин, аррестин, родопсинкиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и тубулин бета 2А могут являться сигнальными партерами фоторецепторного NCS1, поскольку обладают совместной с ним локализацией в наружных сегментах фоторецепторов. Однако стабильный комплекс с NCS1 зафиксирован только в случае аррестина (Кd=2,45±0,47 мкM), а также двух ферментов – родопсинкиназы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Kd=3,01±1,17 мкM), причем активность последних ингибируется под действием NCS1 Са2+-зависимым образом. В дополнение к этим данным, в 2016 году выявлены новые структурные и функциональные свойства NCS1, которые могу реализоваться не только в зрительных нейронах, но и в клетках ЦНС в целом, а также при развитии различных патологических состояний фоторецепторной и нервной систем. Так, по результатам анализа генома Bos taurus (опубликован в 2016 году) получены дополнительные подтверждения существования клетках мозга этого вида новой изоформы NCS1 с альтернативной структурой N-концевого участка, фрагмент которого был обнаружен нами на предыдущем этапе проекта. Кроме того, впервые показана возможность высокоаффинного взаимодействия NCS1 с универсальным Cа2+-сенсором кальмодулином (Kd=10,5±4,0 мкM) и гематопоэтическим цитокином интерлейкином-11 (Kd=10,2±0,05 мкM). Высказаны предположения, касающиеся физиологической роли всех выявленных взаимодействий. |
| 3 |
1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. |
Нейрональный кальциевый сенсор 1 (NCS1) в нормальной и патологической фоторецепторных системах |
| Результаты этапа: Охарактеризованы изоформный состав, локализация, мишени и механизмы регуляции Са2+-сенсорного белка NCS1 в нормальной и патологической фоторецепторных системах. Показано, что, несмотря на различия транскриптов NCS1 у разных видов животных, соответствующие продукты трансляции будут совпадать и являются идентичными NCS1 человека. При анализе протеома одного из животных обнаружена N-концевая сплайс-изоформа NCS1, однако исследования статистически значимого количества особей экспрессию указанной формы не подтвердили. Установлено, что в сетчатке NCS1 локализуется в слое ганглиозных клеток, наружном и внутреннем плексиформных слоях, а также в слое фоторецепторов. Впервые показано присутствие белка в наружных сегментах фоторецепторов, что подтверждено в результате анализа их изолированных препаратов. Показана свето/Са2+-зависимость внутриклеточной локализации фоторецепторного NCS1, который в темноте (высокий Са2+) равномерно распределен на мембранах наружных сегментов, в то время как на свету (низкий Са2+) аккумулируется в мембранных рафт-структурах. Последнее обеспечивается за счет высокоаффинного взаимодействия NCS1 с интегральным белком кавеолином-1, которое реализуется в условиях низкого Са2+ и имеет регуляторный характер, поскольку подавляет активность NCS1 в отношении GRK-киназ. Показано, что NCS1 способен взаимодействовать с фоторецепторными мембранами. Установлено, что профиль и Са2+-зависимость ассоциации NCS1 с клеточными мембранами определяется зарядом фосфолипидов, входящих в их состав, среди которых наиболее предпочтительными являются PI(4)P и PI(4,5)P2. Подобная селективность определяется наличием и положением N-концевых остатков лизина NCS1 (в особенности, К3), которые образуют электростатические контакты с заряженными группами фосфолипидов. Выявлен и идентифицирован ряд Са2+-зависимых и Са2+-независимых потенциальных мишеней NCS1 в сетчатке, среди которых тубулин бета 2А, аррестин, GRK1 и GAPD могут являться партерами фоторецепторного NCS1, поскольку обладают совместной с ним локализацией в наружных сегментах фоторецепторов и образуют стабильные (Кd микромолярного порядка) комплексы в этим белком in vitro. При этом NCS1 оказывает Са2+-зависимые эффекты на активность GRK1 и GAPD, а также на полимеризацию тубулина и мембранную ассоциацию аррестина. Показана возможность взаимодействия NCS1 с кальмодулином, однако взаимодействие не является высокоспецифичным и не модулирует активность обоих белков. Впервые продемонстрирована редокс-чувствительность NCS1 in vivo. Так, в условиях светоиндуцируемого окислительного стресса, ассоциированного с повреждением фоторецепторов, образуются окисленные формы этого белка по остатку C38, а также снижается его общее содержание в сетчатке. Окисление NCS1 усиливает его активность в отношении GRK-киназ, что может указывать на наличие редокс-регуляции этого белка. Наконец, впервые показана и структурно охарактеризована способность NCS1 координировать Zn2+ (3 иона, Кd наномолярного порядка). Связывание Zn2+ не сказывается на регуляторной активности, однако стабилизирует бескальциевую форму белка. При этом избыток свободного Zn2+, который, как известно, образуется в условиях окислительного стресса клеток, вызывает агрегацию NCS1, что, в совокупности с выявленной редокс-чувствительностью этого белка, может вносить вклад в патогенез нейроофтальмологических и неврологических заболеваний. |
