ИСТИНА

Подвижность клеток важна для развития, заживления ран, роста метастазов и т. д. Морфология клеток с мезенхимальным типом подвижности и их способность перемещаться по субстрату зависит от микротрубочек (МТ). Динамичные МТ имеют важное значение для подвижности клеток, и их стабилизация резко замедляет процесс распластывания, замедляет клеточную подвижность и при длительном воздействии вызывает апоптоз. Динамика МТ может быть заблокирована определенными лекарственными препаратами, взаимодействующими непосрественно с молекулами тубулина, а также и путем ингибирования белков, ассоциированных с их плюс-концами. Растущее количество работ, показывает, что раковые клетки более чувствительны, чем нормальные клетки к ингибиторам динамики МТ, и это может способствовать развитию новых подходов в химиотерапии опухолей. Тем не менее, вопрос о механизме (ах) действия микротрубочек во многом остается без ответа. Целью данного проекта является исследование роли динамичных еских МТ в пространственно-временной организации нормальных и раковых клеток с мезенхимальным типом подвижности во время прикрепления, распластывания, поляризации и движения. Мы полагаем, что быстро растущие МТ способствуют радиальному распластыванию, а затем постепенному увеличению ламеллы клетки. Особый интерес представляет относительная чувствительность нормальных и раковых клеток к стабилизации МТ, индуцируемой различными агентами. Мы планируем: (1) детально описать динамику МТ во время прикрепления и распластывания клеток на субстрате (2) Определить влияние стабилизации МТ на прикрепление, распластывание, поляризацию и подвижность клеток. (3) Сравнить влияние препаратов, вызывающих стабилизацию MT (нокодазол, таксол, винорелбин) на процесс прикрепления, распластывания и поляризации нормальных и раковых клеток; (4) Определить роль белков, связанных с плюс–концами микротрубочек, в движении клеток путем ингибировании трансляции EB-белков и сравнить эффекты этого ингибирования в нормальных и раковых клетках.

Проведено детальное исследование поведения плюс-концевых белков группы ЕВ при различных концентрациях нокодазола, таксола и винорельбина. Обнаружено новое свойство плюс-концевых белков семейства ЕВ – их способность связываться с неподвижным плюс концом микротрубочки при воздействии антитубулиновых агентов. Эффекты, вызываемые митостатиками, можно разделить на следующие группы: (1) снижение длины треков плюс-концов микротрубочек при сохранении нормальных комет и уменьшение длины самих комет; (2) появление практически неподвижных агрегатов плюс-концевых белков, которые имеют меньшую длину по сравнению с кометами и симметричный профиль интенсивности; (3) практически полное исчезновение мечения плюс-концов МТ ЕВ-белками. Пороговые дозы, вызывающие существенное снижение длины комет, длины треков и скорости роста МТ оказались для винорельбина в диапазоне 10-20 нМ, для нокодазола – 50-100 нМ, для таксола – 100-200 нМ. Основной эффект винорельбина и нокодазола состоит в укорочении треков, проходимых кометами из ЕВ белков, при этом пространственное расположение треков в клетках меняется незначительно. Основной эффект таксола состоит в пространственном перераспределении треков на периферию клетки, тогда как средняя длина треков меняется незначительно (менее чем на 50%). Для пороговых концентраций всех трех митостатиков характерен гетерогенный ответ клеточной популяции. Проведено исследование роста микротрубочек от центросомы в фибробластоподобных клетках с радиальной системой микротрубочек на моделях клеток 3Т3 и REF. Оказалось, что около 50% МТ, которые начинали расти от центросомы, были короткоживущими, а максимальная длина центросомных МТ составляла ~ 8 мкм. Большинство связанных с центросомой МТ после первоначального роста укорачиваются до нулевой длины и не начинают расти вновь. Таким образом, в фибробластах МТ, закрепленные на центросоме в основном короткие, а радиальная система длинных МТ формируется преимущественно вне связи с центросомой. Подвижность клеток была количественно исследована на модели заживления экспериментальной раны путем одновременной записи процесса в 24-х луночном планшете. Торможение выдвижения клеток в рану в 2 раза и более происходит при воздействии винорельбина и нокодазола в концентрациях 30-100 нМ, а таксола – в концентрации 100 нМ и более. Предварительные данные показывают, что дозо-зависимый эффект установить возможно не всегда, по-видимому, все использованные ингибиторы обладают пороговым эффектом. Синергичный и даже аддитивный эффект от совместного применения пар ингибиторов в диапазоне концентраций 30-300 нМ отсутствует.