| 1 |
27 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. |
Выбор направления исследований. Разработка вариантов технических решений создания функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1 |
| Результаты этапа: Проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов по теме исследований. Подробно в обзоре описаны механизмы и ферменты поли-АДФ-рибозилирования. Проанализировано строение PARP1, каталитическая, ДНК-связывающая актив-ность, репарационная и транскрипционная активность PARP1, механизмы регуляции активностями PARP1. Детально рассмотрено вовлечение PARP1 в процесс канцерогенеза и перспективы использо-вания ингибиторов PARP1 в противо-опухолевой терапии. Подробно описаны три поколения инги-биторов PARP1 и исследование их терапевтического потенциала на примере проведения до-клинических и клинических испытаний. Проведены патентные исследования в соответствии с тре-бованиями ГОСТ 15.011-96. Подробный анализ патентной документации и научно-технической ли-тературы свидетельствует о том, что существует значительный интерес ученых к поиску новых про-тивоопухолевых соединений, к которым относятся ингибиторы фактора PARP1. При этом практиче-ски отсутствуют охранные документы, посвященные теме скрининговых систем для отбора ингиби-торов PARP1. Что в целом, создает благоприятные условия для патентования. Представлено обосно-вание выбора методов и средств, направлений исследований и способов решения поставленных за-дач. Проведена сравнительная оценки вариантов возможных решений исследуемой проблемы. Осу-ществлен подбор и разработка биохимических методов идентификации и определения структур ключевых интермедиатов, формирующихся в присутствии PARP1, в том числе адаптированы для це-лей проекта такие методы, как электрофорез в нативных условиях, электрофорез в денатурирующих условиях, футпринтинг ДНКазой1 и гидроксильный, рестрикционный анализ и др. Проведен дизайн для создания матриц функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1. Осуществлен подбор оптимальных функциональных транскрипционных тестов для проверки активности PARP1 на основе биохимического анализа. В частности, функциональный тест для проверки эффективности транскрипции, тест с ограниченной транскрипцией, тест на определе-ние констант скоростей. Проведены теоретические исследования отдельных факторов влияющих на качество функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1. Проведены необходимые мероприятия по достижению заданных значений программных ин-дикаторов. В частности, подготовлена методическая статья "Preparation and Analysis of Positioned Mononucleosomes", в журнал Methods in Molecular Biology (Sringer) в которой изложена методология использования мононуклеосомных матриц для анализа процессов транскрипции. Публикация при-нята в печать 1 октября 2014. Результаты проведенной работы, в частности, анализ научно-технической и патентной литературы, а также имеющийся практический задел исполнителей ПНИ были представлены индустриальным партнером в виде постеров на мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки. Исполнитель ПНИ также участвовал в работе науч-но-практической конференции "Реализация прикладных научных исследований и эксперименталь-ных разработок по приоритетному направлению Науки о жизни в 2014 году в рамках ФЦП (1-2 де-кабря 2014 года). В предварительных экспериментальных работах начато использование оборудова-ния центра коллективного пользования МГУ имени М.В. Ломоносова "Технологии получения новых наноструктурированных материалов и их комплексное исследование ". Также в начальных экспери-ментах использовали три установки зарубежной инфраструктуры. Показатели "Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей-участников проекта" и "Средний возраст исследователей – участников проекта", «Объем привлеченных внебюджетных средств» превышают запланированные. |
| 2 |
1 января 2015 г.-30 июня 2015 г. |
Теоретические и начало экспериментальных исследований по-ставленных перед ПНИ задач |
| Результаты этапа: Осуществлен подбор оптимального функционального транскрипционного теста для проверки активности PARP1 на основе флуоресцентного анализа. Выбрана техника FRET, поскольку данный метод позволяет изучать конформационные переходы, происходящие внутри сложных макромолекулярных комплексов. Разработаны флуоресцентные методы идентификации и определения структур ключевых интермедиатов, формирующихся в присутствии PARP1: методами FRET. Проведен дизайн и созданы матрицы функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа. Создано 4 вида нуклеосомных матриц с разным расположением меток: серединным, проксимальным, дистальным и на вненуклеосомной части ДНК. Начато создание базы данных, содержащей информацию об ингибиторах PARP1. Проведено компьютерное моделирование молекулярных поверхностей, задействованных во взаимодействии с PARP1. В качестве объекта моделирования использовали BRCT домен PARP1. Такой выбор обусловлен тем, что домен BRCT обеспечивает ключевые взаимодействия белка PARP1 с различными партнерскими белками. Проведенное молекулярное моделирование позволит найти интерфейс, который будет отличаться от интерфейса, к которому направлены классические ингибиторы PARP. Проведена подготовка реализации технических решений для получения функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1. Разработан лабораторный технологический регламент получения функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1, включающего: методику анализа ключевых интермедиатов, формирующихся в присутствии PARP1 биохимическими и молекулярно-генетическими методами; методику анализа ключевых интермедиатов, формирующихся в присутствии PARP1 флуоресцентными методами. Проведено материально-техническое обеспечение экспериментальных работ этапа. Проведены необходимые мероприятия по достижению заданных значений программных индикаторов. В частности, в первом полугодии 2015 были опубликованы 3 статьи (все индексируются в Scopus и Web of Science). Статья №1 «Preparation and analysis of positioned mononucleosomes» by O.I. Kulaeva and V.M. Studitsky//Chromatin Protocols, 3rd Edition, in the Methods in Molecular Biology Series//Publisher: Humana Press// 2015; volume 1288,pages:15-26. DOI: 10.1007/978-1-4939-2474-5_2. Индексируется в Scopus и Web of science. Импакт фактор 1.29. Статья №2 «Молекулярные механизмы регуляции транскрипции фактором PARP1», в журнале «Молекулярная Биология» Выходные данные 2015, том 49, №1, стр 99–113, DOI: 10.1134/S0026893315010094. Статья №3 "Ингибиторы PARP1: разработка противоопухолевых препаратов" в журнале Acta Naturae Выходные данные: 2015, том 7 № 3 стр 25 -36. Результаты проведенной работы были представлены индустриальным партнером в виде постеров на мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки (отчет о мероприятиях представлен отдельным документом). В экспериментальных работах используется оборудование ЦКП МГУ имени М.В. Ломоносова "Технологии получения новых наноструктурированных материалов и их комплексное исследование", а также три установки зарубежной инфраструктуры. Показатели "Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей-участников проекта" и "Средний возраст исследователей – участников проекта", «Объем привлеченных внебюджетных средств» превышают запланированные. |
| 3 |
1 июля 2015 г.-31 декабря 2015 г. |
Экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач. Получение экспериментальных образцов и проведение тестовых испытаний |
| Результаты этапа: В рамках выполнения работ по 3 этапу были получены экспериментальные образцы ЭО№№1-4; разработана программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов; разработаны методики контроля качества и анализа экспериментальных образцов; проведены испытания экспериментальных образцов ЭО №№1-4 в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний; доработана база данных, содержащей информацию об ингибиторах PARP1; проведены дополнительные патентные исследования, осуществлено материально-техническое обеспечение экспериментальных работ этапа 3 в необходимом объеме; обеспечено участие в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию результатов проекта (международные и отечественные научно-практические конференции, биотехнологические и биомедицинские выставки семинары, симпозиумы, и т.п.). Подготовлена диссертация на соискание степени кандидата биологических наук по теме «Хроматин-специфичная остановка РНК-полимераз на повреждениях ДНК» Герасимовой Надеждой Сергеевной. Подана патентная заявка «Способ скрининга противоопухолевых препаратов- ингибиторов PARP1 на основе биохимических методов анализа» №2015152272 от 07.12.2015 г. |
| 4 |
1 января 2016 г.-30 июня 2016 г. |
Экспериментальные исследования поставленных пе-ред ПНИ задач. Создание макета функциональной системы скринин-га противоопухо-левых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1 |
| Результаты этапа: Получены экспериментальные образцы ЭО№5;
Проведены тестовые испытания ЭО№5 в соответствии с Программой и методиками испытаний;
Изготовлен макет функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1;
Проведены испытания макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1;
Подготовлено заключение по итогам испытаний макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1
|
| 5 |
1 июля 2016 г.-31 декабря 2016 г. |
Обобщение и оценка полученных результатов |
| Результаты этапа: Проведен дизайн и созданы матрицы функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализаPARP1. Создана база данных, содержащей информацию об ингибиторах PARP1 (http://parp1inhibitors.ru/). Проведено компьютерное моделирование молекулярных поверхностей, задействованных во взаимодействии с PARP1. Разработан лабораторный технологический регламент получения функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1. Были получены экспериментальные образцы 5 различных типов и разработана программа и методики исследовательских испытаний ЭО. Проведены тестовые испытания ЭО в соответствии с Программой и методиками испытаний. Были разработаны экспериментальные образцы, в которых сымитированы более сложные уровни организации хроматина по сравнению с мононуклеосомными системами, которые были использованы в качестве прототипов для создания тест-системы скрининга ингибиторов PARP1. Получены две системы: одна на базе мононуклеосомной матрицы, но с двухлинкерными участками, в которые размещены флуорофорные метки. Вторая система – динуклеосомная, собрана из двух рядом расположенных нуклеосом, что позволяет оценивать влияние нескольких нуклеосом в системе. Проведены предварительные испытания ингибиторов PARP1 (олапариаб и госсипола) в двух системах, которые продемонстрировали, что данные системы нуждаются в дальнейшей доработке для доведения до стадии макета. Были проведены дополнительные работы по компьютерному моделированию взаимодействия PARP1 c ингибиторами. Было проведено технико-экономическое
обоснование (ТЭО) разработки с учетом технологических возможностей индустриального партнера. Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов поисковой ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках. Разработан проект ТЗ на ОКР по теме: «Широкомасштабный скрининг в функциональной PARP1- системе с целью обнаружения перспективных противоопухолевых соединений. Проведено обобщение результатов исследований. Результаты работы опубликованы в 5 статьях (все индексируются в Scopus и Web of
Science) и доложены в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию результатов проекта в виде постеров и устных докладов |
