Челюстные аппараты MolluscaНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 28 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Челюстные аппараты Mollusca
Результаты этапа: В результате проекта будут получены оригинальные данные по строению буккального комплекса органов для одного вида Polyplacophora, двух видов Opistobranchia, одного вида Patellogastropoda, одного вида Fissurellidae и одного вида Conidae. Будут получены данные по ультратонкому строению радулярного влагалища всех изучаемых видов и элементарному составу радул. С помощью иннуноцитохимических методов окраски будут получены новые данные по химическому составу радулы, по зонам пролиферации. Все это позволит определить основные направления эволюции радуларных аппаратов и определит границы морфологической изменчивости. Благодаря относительно новому подходу трехмерной реконструкции в морфологии наши исследования позволят детализировать строение буккального комплекса, определить топографию органов, предположить механизмы работы аппаратов в зависимости от питания. Данные по тонком строению позволят проверить гипотезы о механизмах формирования, возобновления и движения зубов радулы. Обобщенные разультаты проекта позволят выдвинуть гипотезы о направлениях развития челюстных образованиях как в группе моллюсков, так и трохофорных животных. Все разультаты планируется опубликовать в международных журналах в виде минимум пяти публикациях. Также планируется представить результаты на международных конференциях. Описание ожидаемых результатов на 2015 год: Май – июль. Сбор необходимого для морфологических исследований материала Polyplacophora, Opistobranchia, Patellogastropoda, Fissurellidae (не менее 10 особей каждого объекта) и отработка экспериментов по изучению механизма питания по изучению зон пролиферации в зонах роста радулы. Для этого будут выбраны разные виды беломорских голожаберных моллюсков и проведены серии экспериментов по содержанию живых объектов в разных концентрациях меток на S-фазу митотического деления (метка EDU и BRDU) разное количество времени (старт от 3 до 24 часов), с последующей фиксацией объектов, имунно-цитохимическим окрашиванием и изучением с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Экспедиция основных участников проекта на ББС МГУ. Защита дипломной работы. Июль – август. Изучение аппарата буккальной полости Conidae с помощью сканирующей электронной микроскопии (СКАН), изготовление серий полутонких срезов. Приготовление серий срезов для последующей трехмерной реконструкции (фотографирование, выравнивание и масштабирование). Август – сентябрь. Проведение трехмерной реконструкции фарингеального комплекса органов для Conidae. Приготовление ультратонких срезов для изучения ультратонкой морфологии с помощью трансмисионного электронного микроскопа. Сентябрь – декабрь. Анализ полученных результатов, написание готового отчета. В результате первого года проекта будут получены следующие результаты: 1) будет собран весь необходимый материал, зафиксирован и обработан соответственно применяемым методам исследований. 2) Проведены эксперименты и подобраны объекты для изучения механизма питания и зон пролиферации в зонах роста радулы. 3) Проведены исследования с помощью сканирующего электронного микроскопа Conidae. 4) Изготовлены необходимые серии полутонких срезов для Conidae и Polyplacophora. 5) Будет реконструирована буккальная полость Conidae и Polyplacophora. 6) Будет подготовлена публикация по одному виду Opistobranchia по наработанному материалу. 7) Будет подготовлен годовой отчет.
2 1 января 2016 г.-31 января 2016 г. Челюстные аппараты Mollusca
Результаты этапа: В результате второго года проекты были решены все поставленные задачи для второго года. Изучение буккального комплекса органов Vayssierea elegans (Opisthobranchia, Okadaiidae). Для изучения буккального комплекса органов V. elegans было изготовлено три серии полутонких срезов: 2 серии срезов в поперечной плоскости и 1 серия срезов в сагиттальной плоскости. По двум сериям поперечных полутонких срезов были построены трехмерные реконструкции. Для изучения общей морфологии радулы были отпрепарированы и высушены на воздухе две радулы. Тонкое строение основных групп мускулатуры, эпителия ротовой трубки и буккальной полости, а также кутикулярных структур была изучена одна особь V. elegans по срезам в сагиттальной плоскости. В результате морфологических исследований были получены следующие результаты: буккальный комплекс V. elegans включает внешнюю и внутреннюю буккальную мускулатуру, буккальную полость с дорсально отходящим пищеводом и радулярный аппарат. Челюсти отсутствуют. У данного вида также отсутствуют ротовые щупальца, однако клетки эпителия ротового отверстия и ротовой трубки несут длинные реснички, что предполагает наличие чувствительной функции у данных зон. Внешняя буккальная мускулатура V. elegans представлена дилататорами ротовой трубки, задним буккальным тенсором и буккальным ретрактором. Внутренняя буккальная мускулатура V. elegans представлена большим количеством мышц, состоящих из небольших мышечных пучков: констриктором буккальных губ, буккальным сфинктером, вентральным и латеральными протракторами одонтофора, ретрактором одонтофора и радулярным ретрактором. Согласно данным по ультраструктуре буккальная мускулатура представлена гладкими мышцами. Радулярный аппарат расположен вентрально в буккальной полости и состоит из одонтофора, радулы и радулярного влагалища. Одонтофор V. elegans на сагиттальном срезе имеет пальцевидную форму; его длина у трехмиллиметровой особи составляет 400 мкм, а высота – 80-90 мкм. Он состоит из 4 групп буккальных мышц: вентрального и латеральных протракторов одонтофора, ретрактора одонтофора и радулярного ретрактора. Хрящи одонтофора или радулярный валик – дополнительные опорные структуры – отсутствуют. Радула V. elegans на всем протяжении подостлана радулярной мембраной, имеет V-образную форму на сагиттальном срезе, причем вентральная ветвь радулы приблизительно равной длины с дорсальной. В поперечном ряду насчитывается 6 зубов: два внутренних, сильно зазубренных латеральных зуба; два внешних гребенковидных латеральных зуба и два маргинальных зуба в виде пластинки. Центральный зуб отсутствует. Радулярная формула для V. elegans: 35-40×1.2.0.2.1. По данным трансмиссионной электронной микроскопии зрелые зубы имеют электронно-плотную, гомогенную структуру. Радулярное влагалище V. elegans выстлано супрарадулярным (верхним) и субрадулярным (нижним) эпителиями, в терминальном конце радулярного влагалища обнаружены крупные, специализированные клетки – одонтобласты и мембранобласты. Для V. elegans характерен сверлящий тип питания. Эти моллюски сверлят отверстия в трубках полихет-представителей сем. Spirorbidae и сем. Serpulidae. Как только моллюск с помощью чувствительных, покрытых ресничками участков в области ротового отверстия находит подходящий для сверления участок трубки, сокращаются дилататоры ротовой трубки и расслабляются буккальный ретрактор и констриктор буккальных губ, таким образом открывая радулярному аппарату доступ к стенке трубки. При сокращении вентрального протрактора одонтофора и расслаблении радулярного ретрактора и ретрактора одонтофора одонтофор с радулой выдвигается вперед и контактирует со стенкой трубки. Сверлящее движение радулы и одонтофора обеспечивается попеременным сокращением латеральных протакторов одонтофора. После того, как отверстие просверлено, ретракторы радулы и одонтофора сокращаются, латеральные и вентральный протракторы одонтофора расслабляются. Высасывание полихеты из трубки и измельчение ее в буккальной полости обеспечивается координированной работой буккального сфинктера и заднего буккального тенсора. При этом констриктор буккальных губ находится в сокращенном состоянии, перекрывая сообщение буккальной полости и внешней среды для того, чтобы избежать выпадения пищи. Изучение буккального комплекса органов Eubranchus rupium (Opisthobranchia, Eubranchia) Для изучения морфологии буккального комплекса E.rupium было собрано 12 взрослых особей размером 0,5-1 см в окрестностях Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова в проливе Великая Салма (Кандалакшский залив, Белое море) в летний период 2016 г. Для изучения кутикулярных структур буккального комплекса E. rupium радулы и челюсти 5 особей были отпрепарированы и высушены на воздухе. Для изучения мускулатуры буккального комплекса E.rupium 4 особи данного вида были расслаблены, зафиксированы в 4% PFA на PBS и окрашены флуоресцентными красителями: 1 особь была окрашена Propidium iodide (нуклеиновые кислоты) и Phalloidin FITC (актиновые филаменты в мышцах); 1 особь была окрашена PhallAcidin 607 (актиновые филаменты в мышцах), DAPI (нуклеиновые кислоты), Propidium iodide (нуклеиновые кислоты); DAPI (нуклеиновые кислоты), PhallAcidin 607 (актиновые филаменты в мышцах). В буккальный комплекс E.rupium входят челюсти, внешняя и внутренняя мощная буккальная мускулатура, буккальная полость с дорсально отходящим от ее середины пищеводом и радулярный аппарат, расположенный вентрально. Внешняя мускулатура буккального комплекса представлена двумя группами мышц, первая из которых соединяет переднюю часть буккального комплекса с дорсальной стенкой гемоцеля – буккальный ретрактор, а вторая начинается от терминального конца радулярного влагалища и оканчивается в нижней губе моллюска – ретрактор губ. Внутренняя буккальная мускулатура представлена мощными раскрывателями челюстей и протракторами и ретракторами одонтофора. Эпителий буккальной полости формирует две обширные латеральные складки, в которых располагаются челюсти и радулярное влагалище, где формируется радула. Челюсти, как и буккальный комплекс, вытянуты в передне-заднем направлении. Они представляют собой парные челюстные пластинки, лежащие в складках буккального эпителия и несущие в передней части длинные, изогнутые дугой жевательные отростки с зубчиками по краю. Радулярный аппарат E. rupium включает радулу, одонтофор и радулярное влагалище. Радула E. rupium трисериальная, каждый поперечный ряд содержит один центральный зуб и два латеральных. Одонтофор представлен двумя группами буккальных мышц, хрящи одонтофора или радулярные валики отсутствуют. Радулярное влагалище выстлано супрарадулярным (верхним) и субрадулярным (нижним) эпителиями, в терминальном конце радулярного влагалища обнаружены одонтобласты и мембранобласты. Изучение зон пролиферации иммуноцитохимическим методом не дало ожидаемых результатов. В течение летнего сезона 2016 года был проведен ряд экспериментов с разными видами моллюсков (Eubranchus rupium, Testudinalia tesulata, Puncturella naochina). Все эксперименты проводились с живым материалом на беломорской биологической станции МГУ (Белое море, Кандалакшский залив). Исследуемые виды имеют довольно крупные размеры и выделяют большое количество слизи, что препятствует проникновению BRDU, поэтому вероятнее всего изучать локализацию зон пролиферации для этих видов этим методом затруднительно или даже невозможно. Исследование буккального комплекса органов Conus ulucarius Буккальный комплекс органов C.ulucarius, согласно трехмерной реконструкции, состоит из радулярного мешка, ядовитой железы, слюнной железы, мускулатуры. Радулярный мешок и ядовитая железа открываются независимо в буккальный мешок. Протока слюнной железы обнаружено не было. Ядовитая железа имеет два изгиба, практически вдвое длиннее радулярного мешка, железистые клетки высокие, забиты плотными однородными включениями, ядра располагаются базально. Есть мышечная обкладка. Слюнная железа короткая с прозрачным содержимым. Мускулатура имеет сложную форму и окружает все составляющие буккального комплекса. Большое количество округлых, похожих по окрасу на кровеносные лакуны, располагаются около всех частей буккального комплекса. Радулярный мешок изогнутый, имеет только один рукав, в базальной части располагаются одонтобласты и формируется радула. На изгибе с вентральной стороны располагается поддерживающая структура, вероятнее всего соединительнотканной природы. Радула Conus короткая, лишена мембраны, состоит из 30 зубов. Зубы первых несколько рядов (около 4-5 рядов) формируют правильные ряды по два маргинальных в ряду. Далее ряды теряют свою правильность и терминальня часть радулярного мешка забита зрелыми зубами. Все зубы лежат базальной частью к отверстию, в буккальном мешке лежат зрелые зубы. Игла без зубцов в апикальной части, представляет собой двойную закрученную спираль. Канал зуба заполнен клетками у не совсем зрелых зубов. Зрелые зубы заполнены то ли клеточным, то ли не клеточным материалом. Основание зубе погружено во внеклеточный матрикс (лигамент или мембрана). В апикальной части радулярного мешка располагается зона одонтобластов. Это две не очень многочисленные группы клеток, которые располагаются по радиусу и формируют овальные полости, которые продолжаются до конца зоны формирования. На полутонких срезах видно, как в этих полостях формируется плотная пластинка, вероятно, она и является основой для формирования зуба. Между двумя зонами одонтобластов есть еще одна полость, которая выстлана эпителием, от которого отделяются волосовидные структуры. Вероятно в этой полости зуб заканчивает свое формирование. Данные по морфологии и ультратонкому строению радулярного аппарата Flabellina verrucosa и Testudinalia tesulata были доведены до публикаций. Строение радулы и челюсти F. verrucosa Эпителий буккальной полости формирует две обширные латеральные складки, в которых формируются челюсти и одну терминальную складку – радулярное влагалище – где формируется радула. Челюсти покрывают спереди две трети буккального комплекса органов наподобие шлема, челюстные пластинки расположены в латеральных складках буккального эпителия, однако внутренняя поверхность передней части челюстных пластинок не покрыта эпителием и обращена в буккальную полость, также не погружены в эпителий длинные, прямые, несущие один ряд зубчиков по краю, жевательные отростки. Пластинки челюстей соединены между собой кольцевым эластичным лигаментом, окружающим переднюю часть буккального комплекса. Задние края челюстных пластинок не соединены между собой. На ультраструктурном уровне челюсть предстает трехслойной: внешние гладкие, электронно-плотные слои формируются за счет слияния кутикулы эпителия с матриксом челюсти, а средний фибриллярный электронно-прозрачный слой синтезируется специализированным гнатоэпителием, располагающимся в двух зонах роста: задней, формирующей основную челюстную пластинку, и передних, формирующих жевательные отростки. Радулярный аппарат F. verrucosa включает радулу, одонтофор и радулярное влагалище, в котором происходит синтез зубов радулы и радулярной мембраны. Радула данного вида трисериальная, в каждом поперечном ряду есть центральный зуб и два латеральных. Радулярная формула для F. verrucosa: 15-21×1.1.1. Одонтофор представляет собой опорную структуру, включающую радулярный ретрактор, протрактор одонтофора и радулярный валик, состоящий из видоизмененных, сильно вакуолизированных мышечных клеток. Зубы радулы и радулярная мембрана синтезируются в терминальном конце радулярного влагалища. За синтез зубов радулы и радулярной мембраны отвечают специализированные клетки – одонтобласты и мембранобласты соответственно. Согласно данным TEM они представляют собой крупные, объемистые клетки с большим количеством рибосом и митохондрий, хорошо развитым шероховатым ЭПР. Апикальная поверхность одонтобластов и мембранобластов несет длинные толстые микровилли, пронизывающие материал зуба радулы и радулярную мембрану. В апикальной части одонтобластов и мембранобластов были обнаружены везикулы с гранулярным хитином – хитосомы; обе группы клеток подостланы базальной мембраной. На ультраструктурном уровне в незрелом зубе радулы можно выделить 4 зоны, различающиеся направлением и плотностью расположения хитиновых волокон. Согласно данным конфокальной микроскопии с внешней поверхности зубов третьего поперечного ряда радулы начинается процесс полимеризации хитина. Синтез радулы F. verrucosa проходит в 4 этапа: 1) одонтобластами синтезируется коллагеновый колпачок зуба; 2) зуб поворачивавется на 90º и прикрепляется к радулярной мембране, синтезируемой непрерывно; 3) под коллагеновым колпачком зуба начинает накапливаться неполимеризованный хитин из хитосом одонтобластов; 4) по мере продвижения зуба от терминального конца радулярного влагалища у его устью, хитин в матриксе зуба полимеризуется, и зуб минерализуется. В процессе минерализации зуба принимает участие супрарадулярный эпителий радулярного влагалища, в транспортировке радулы к рабочему краю принимает участие субрадулярный эпителий радулярного влагалища. Для F. verrucosa описан всасывающе-измельчающий тип питания, проходящий в 3 основных этапа: 1) при одновременном сокращении всех групп буккальной мускулатуры в буккальной полости создается отрицательное давление, благодаря чему в нее засасывается гидрант, 2) эластичный кольцевой лигамент челюстей сжимает челюсти. Ножка гидранта, таким образом, зажимается между жевательными отростками челюстей, 3) в буккальной полости про помощи радулы происходит измельчение кусочков пищи и проталкивание их в пищевод. Ультратонкое строение радулы Testudinalia tesulata Ультратонкое строение одонтобластов Каждая группа одонтобластов содержит огромное количество клеток. Согласно ультраструктурным данным одонтобласты очень узкие (2,5 – 3 мкм) и вытянутые (до 170 мкм). Крупные овальные ядра (до 13 мкм в длину и 2 мкм в ширину) располагаются в несколько уровней, создавая псевдомногослойный эпителий. Базальная пластинка электронно-плотная, достигает 0,4 мкм. Одонтобласты делятся на две части: базальную, в которой содержится ядро, ЭПР, аппарат Гольджи и апикальную. Апикальная часть с электронно-прозрачной цитоплазмой и большим количеством митохондрий и электронно-плотными гранулами. В цитоплазме содержатся микротрубочки в большом количестве и тянутся вдоль клетки. Одонтобласты соединены десмосомами и щелевыми контактами в апикальной части, которые формируют заметную даже на световом уровне. Под зоной десмосом есть базальные тела, ресничек не обнаружено. Апикальные части одонтобластов пронизывают первичный чехлик. На конечной стадии созревания нового чехлика найдены деградирующие участки в группах одонтобластов, которые расположены в районе между базальной и апикальной частями одонтобластов. Для зубов на более ранней стадии таких участков обнаружено не было. Участки деградации характеризуются разрушением мембран, неправильной формой электронно-плотного ядра, практически с разрушенной мембраной, больший количеством вакуолей разной электронной плотности. Группы одонтобластов отделены друг от друга специализированными клетками, которые имеют вытянутую форму и электронно-плотную цитоплазму. Ультратонкое строение зуба Первичный зуб (чехлик) формируется путем апокринной секреции, состоит из вакуолей с электронно-плотным содержимым. Следующая стадия созревания чехлика – это формирование более гомогенного зуба с небольшим количеством вакуолей. Основание зуба сформировано крупными вакуолями с электронно-плотным содержимым. Ближе к центру вакуоли сливаются, формируя центральную часть зуба, состоящего из электронно-плотного относительно гомогенного материала, в котором располагаются некрупные вакуоли. Центральная и терминальная часть зуба состоит из электронно-плотных коротких и тонких фибриллы, которые агрегируются в тяжи. Сформированный, но еще не отошедший от зоны одонтобластов зуб имеет форму созревших зубов, состоит из средней электронной плотности гомогенного материала с продольно ориентированными волокнами. Дальнейший процесс созревания зуба проходит в складках субрадулярного и субпрарадулярного эпителиев перед тем, как зуб прикрепится к мембране. Граница между мембраной и зубом явно заметная и цементирующий материал не отличается от молод ой мембраны. В результате обработки полученных результатов по морфологии и ультратонкого строения радулы Testudinalia tesulata и Flabelliba verrucosa, были подготовлены к печати две статьи: 1) Anna L. Mikhlina, Alexander B. Tzetlin and Elena V. Vortsepneva. Fine morphology of buccal armature of Flabellina verrucosa (Nudibranchia: Aeolidida: Flabellinidae) Journel of molluscan studies. 2) Elena Vortsepneva, Dmitry Ivanov, Alexander Txetlin. General and fine morphology of radula of Testudinalia tesulata (Mollusca: Gastropoda). Journal of Morphology. В результате второго года проекта был получен обширный материал по общей морфологии ультратонкому строению буккального аппарата пяти видов моллюсков, который станет основой для обобщений и выявлений общих закономерностей формировании челюстных образований Mollusca.
3 1 января 2017 г.-22 декабря 2017 г. Челюстные аппараты Mollusca
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".