![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Апикальная меристема (АМ) побега представляет собой важнейшую образовательную ткань в организме растения, которая даёт начало всем прочим надземным органам - стеблям, листьям, цветкам. Активность АМ контролируется множеством генов, часть которых охарактеризована на традиционном модельном объекте генетики развития растений - Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (сем. Крестоцветных). У A. thaliana побеги всех порядков организованы сходным образом: главный побег непосредственно несёт цветки (простое соцветие), в пазухах листьев образуются побеги второго порядка, строение которых повторяет главный побег. У гороха посевного (Pisum sativum L., сем. Бобовых) цветки расположены на специализированных побегах (сложное соцветие), то есть присутствуют побеги двух типов с разной активностью апикальных меристем. Генетический контроль АМ, образующих такую побеговую систему, представляет большой фундаментальный и практический интерес, но изучен слабо. Предлагаемый проект ориентирован на идентификацию новых генов, контролирующих активность АМ разных типов у гороха, локализацию этих генов на генетической карте, возможную идентификацию на молекулярном уровне. Планируется охарактеризовать особенности наследования, взаимодействия, фенотипического проявления, экспрессии таких генов. На основании данных, полученных для гороха, будут описаны особенности функционирования ортологичных генов у родственных гороху видов Бобовых - люцерны, галеги, лядвенца и др. Полученные результаты будут обобщены в виде модели генетического контроля активности АМ побега у бобовых. Данная модель позволит сформулировать основные принципы эволюционных преобразований побеговой системы и соцветия в группе, а также конкретных генов, контролирующих эти преобразования.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Структурно-функциональный анализ генов, контролирующих активность апикальной меристемы побега у гороха посевного (Pisum sativum L.) и родственных бобовых |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Структурно-функциональный анализ генов, контролирующих активность апикальной меристемы побега у гороха посевного (Pisum sativum L.) и родственных бобовых |
Результаты этапа: 1. Размер генома как фактор, влияющий на размер апикальной меристемы В ходе отчетного этапа был предпринят поиск корреляции между размерами апикальной меристемы у бобовых с размером их генома. Горох относится к трибе Виковых, в которую входят также два высоко полиморфных рода – Чина (Lathyrus) и Вика (Vicia), имеющие большое хозяйственное значение как зернобобовые (вика посевная, вика нарбонская, чина посевная, бобы), кормовые, укосные (мышиный горошек, чина луговая) и декоративные (душистый горошек) культуры. В соответствии с базой данных по размерам геномов растений (http://data.kew.org/cvalues), представители трибы Виковых имеют самые большие геномы среди всего семейства, но при этом характеризуются относительно небольшим числом хромосом (2n = 10-14 у большинства представителей, преобладают 2n = 14). Полиплоидия в этой группе редка. Известно, что размер генома положительно коррелирует с размером клеток за счет ядерно-цитоплазматического соотношения и отрицательно – с длительностью клеточного цикла. В связи с этим была высказана гипотеза о том, что размер генома у бобовых может влиять на размер апикальной меристемы и длительность жизненного цикла (однолетний или многолетний). В коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ были выбраны образцы, относящиеся к роду Чина. Часть материалов была собрана в природных условиях во время поездки в Армению. У трехнедельных растений фиксировали апексы побега и с использованием метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) получали их фотографии в различных проекциях. На фотографиях оценивали размеры АМ и составляющих ее клеток (как площадь наружной поверхности клеток поверхностного слоя АМ). Удалось показать, что у пяти видов чины (L. cicera, L. clymenum, L. sylvestris, L. tingitanus и L. articulatus) есть положительная корреляция между размером генома (взят из вышеупомянутой базы данных) и размером клеток АМ, а также размером самой АМ . Планируется расширить выборку за счет других видов чины и вики, а также гороха, но можно заключить, что увеличение размера генома приводит к укрупнению АМ. Интересная зависимость найдена между размером генома и длительностью жизненного цикла. Среди 41 вида чины многолетники характеризуются или большим, или малым размером генома, в то время как однолетники имеют средние размеры генома. У вики (51 вид) ситуация обратная: однолетники имеют или малые, или большие размеры генома, многолетники – средние. Подобная корреляция выглядит неслучайной. Для организма с большим геномом может оказаться адаптивно выгодным или завершить жизненный цикл за один сезон (сведя, таким образом, онтогенез к небольшому числу клеточных делений), или, напротив, в течение первого года жизни сформировать корневище или иной многолетний орган и перейти к цветению во второй и последующий годы жизни. Таким образом, эти результаты свидетельствуют об определённом морфогенетическом значении размера генома (размер АМ связан с ним положительно). Также содержание ДНК в ядре, по-видимому, имеет большое значение в эволюции жизненной формы в изученной группе. Планируется расширить выборку объектов для морфометрии - в первую очередь, за счёт видов рода Vicia. 2. Анализ CLAVATA3-подобного гена у гороха В ходе предыдущих исследований было показано, что ген FAS, мутация в котором определяет фасциацию у линии «Штамбовый», локализован в III группе сцепления (ГСIII). Исходя из синтении этого района генома гороха с геномом люцерны (Medicago truncatula), было высказано предположение, что этот ген представляет собой ортолог гена CLAVATA3 (CLV3) Arabidopsis thaliana. Последовательность, сходная с CLV3, была охарактеризована (но не опубликована) у гороха в работе (Liang et al. 2009. J. Exp. Bot. 60: 4201-4213) и любезно предоставлена авторами процитированной статьи для нашей работы. На основе нее нами были подобраны праймеры, успешно проведена амплификация. Полученный фрагмент, амплифицированный у мутанта «Штамбовый» и 30 других сортов и линий (преимущественно сортов отечественной селекции), был обработан рядом эндонуклеаз рестрикции с целью обнаружить межлинейный рестрикционный полиморфизм. При обработке эндонуклеазой AluI было найдено два аллеля. Мутант «Штамбовый» имеет «тяжёлый» аллель, характерный для большинства проанализированных сортов и линий. Несколько форм (среди них маркерная линия WL1238) имеют «лёгкий» аллель. При генотипировании популяции F2 от скрещивания «Штамбовый» x WL1238 было отмечено, что все растения, имевшие фасциированный фенотип, гомозиготны по «тяжёлому» аллелю PsCLV3. Таким образом, можно судить как минимум о тесном сцеплении PsCLV3 (ранее не локализован) с геном FAS в ГСIII. Для подтверждения тождества этих маркеров требуется дополнительное исследование, которое будет проведено в третий год реализации проекта. Нами были получены нуклеотидные последовательности фрагментов PsCLV3 от мутанта «Штамбовый» и сорта Немчиновский-766, из которого был получен данный мутант. К сожалению, полученные данные не позволяют однозначно судить о различиях между двумя образцами по данному локусу. В дополнение к фенотипической характеристике мутанта «Штамбовый» совместно с сотрудниками ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин) было проведено сравнение числа симбиотических клубеньков на корнях мутанта по сравнению с исходным сортом (Немчиновский 766). Было показано, что у фасциированного мутанта «Штамбовый» число азотфиксирующих клубеньков достоверно выше (135,1±49,0, приведено среднее значение ± стандартное отклонение), чем у сорта Немчиновский 766 (99,9±23,9, t-критерий, p = 0,029). Эти результаты согласуются с тем, что как минимум у двух известных фасциированных мутантов гороха (sym28 и nod4) число клубеньков на корнях выше, чем у исходных нефасциированных сортов. 3. Апикальная и флоральная меристемы у мутантов бобовых На материале коллекции кафедры генетики было проведено сравнение фенотипов 4-х фасциированных неаллельных мутантов гороха (fas, fa2, sym28, nod4) и исходных сортов, из которых эти мутанты в разное время были выделены. Кроме того, в сравнение были включены фасциированный мутант люпина узколистного (Lupinus angustifolius) 5М2-253 и исходный сорт Немчиновский 846. Все перечисленные мутанты характеризуются выраженной фасциацией главного побега. Было обнаружено, что мутанты гороха отличаются от исходных сортов достоверно меньшим числом цветков в пазушном соцветии и в некоторых случаях меньшим числом семязачатков в бобе. Никаких аномалий строения цветка, которые бы сопутствовали фасциации у гороха, отмечено не было. Мутант nod4, выделенный К.К. Сидоровой из зернового сорта Рамонский 77, цветет достоверно раньше исходного сорта. В остальных случаях мутанты гороха имели сходное с сортами число стерильных узлов. Напротив, у люпина фасциация побега сочеталась с ранее не описанными нарушениями цветка. В цветках мутанта 5М2-253 отмечалось увеличенное количество органов всех типов, хотя их дифференцировка в целом нормальна: лепестки трех типов присутствуют более или менее на своих местах, тычинки можно отнести к наружному или внутреннему кругу. Нередки и случаи увеличения числа плодолистиков до 2-3. Можно заключить, что у гороха размер меристемы находится под негативным контролем, который дублирует действие негативных регуляторов размеров АМ. У Arabidopsis фасциация (утрата негативной регуляции размеров меристемы) побега, как правило, сочетается с увеличением числа органов в цветке. По-видимому, по крайней мере, один из генов, контролирующих размер АМ у люпина, является и регулятором размера флоральной меристемы, что приводит к плейотропному проявлению этой мутации. Хотя ген на данный момент не идентифицирован, описанный мутант представляет значительный интерес с точки зрения понимания регуляции и эволюции размеров меристемы цветка у бобовых - в том числе и в свете проблемы происхождения у них полимерного гинецея. 4. Связь стабильности апикальной и флоральной меристем при нормальном морфогенезе Для изучения связи размеров флоральной меристемы (ФМ) с размерами апикальной меристемы (АМ) была предпринята оценка стабильности числа органов в цветках у нескольких видов бобовых (горох посевной, мышиный горошек Vicia cracca, люпин многолистный Lupinus polyphyllus) и представителей других семейств средней полосы России. Всего в анализ были взяты 37 видов, относящихся к 23 семействам. Материал (обычно не менее 100 цветков) собирали так, чтобы минимизировать генетические различия - по возможности с одной особи или по крайней мере в одной популяции. Учитывали положение цветка в соцветии. При статистической обработке полученных данных были установлены следующие закономерности. (1) Стабильность цветка, выраженная через коэффициент вариации числа его структур, зависит от положения цветка в соцветии. Так, верхушечный цветок на главном побеге обычно сильнее всего уклоняется от типичного строения в сторону как большего, так и меньшего числа структур. У некоторых видов (например, у Ruta graveolens и Lythrum salicaria) мерность (количество органов в круге) цветка регулярно связана с его положением в соцветии. Такая связь размеров АМ и ФМ выглядит наиболее логичной: ФМ верхушечного цветка формируется непосредственно из АМ побега. Этот процесс сопряжен с быстрым изменением симметрии и особенностей разметки меристемы и оттого подвержен ошибкам. (2) Чем выше мерность цветка, тем более она склонна к варьированию. Так, двучленная чашечка у Крестоцветных в изученном материале не обнаруживала никаких вариаций, в то время как семичленная чашечка у Trientalis оказалась нестабильной, часто встречались 6- и 8-членные варианты строения. Таким образом, с увеличением средней мерности чашечки возрастает коэффициент вариации числа чашелистиков (коэффициент корреляции Спирмена ρ = 0.4388, p = 0.0120). У этой закономерности есть убедительное обоснование. В общем виде оно сводится к тому, что вставка дополнительного примордия в круг цветка (увеличение мерности) тем проще, чем больше примордиев уже могут быть в нем размечены. (3) Зигоморфные цветки (в том числе у Бобовых) стабильнее актиноморфных. Этот факт хорошо согласуется с вышеупомянутым наблюдением: даже при фасциации побега зигоморфный цветок (по крайней мере, у гороха) остается неизменным. Зигоморфный цветок имеет дополнительные механизмы стабилизации размеров ФМ. Наиболее вероятными кандидатами на роль таких регуляторов выступают CYCLOIDEA-подобные гены. Ген CYCLOIDEA (CYC) открыт у львиного зева и является основным регулятором симметрии цветка. Показано, что он подавляет экспрессию генов циклинов в адаксиальной части ФМ (Gaudin et al. 2000. Plant Physiol. 122: 1137-1148). CYC-подобные гены участвуют в контроле симметрии цветка у разных групп цветковых растений. Таким образом, зигоморфные цветки более устойчивы к случайным флуктуациям размеров ФМ. 5. Наследование и фенотипическое проявление мутации determinate habit Продолжена и завершена работа по изучению характера наследования признака детерминантного типа роста (ДТР), определяемого мутацией determinate habit. В первый год реализации проекта было показано, что гибриды первого поколения от скрещиваний deh × DEH имеют промежуточный фенотип по числу продуктивных узлов. Было высказано предположение, что материнский генотип оказывает влияние на фенотип гетерозигот. в этом году были детально изучены гибриды F1 от скрещиваний «Рас-тип» (deh) × Аз-23 (DEH) и Флагман (deh) × Filby (DEH). В обеих комбинациях отдельно анализировали группы потомков от прямого и обратного скрещиваний. Гибриды F1 от прямого и обратного скрещиваний достоверно не различались по числу продуктивных узлов. В трех случаях гетерозиготы имели фенотип, промежуточный между родителями; исключение составляет популяция F1 Флагман × Filby (2015 г.). Эти данные свидетельствуют о полудоминантном характере наследования мутации deh. Также во всех комбинациях у части (6,3-30,8%) гибридов F1 наблюдали редуцированные или асимметричные прилистники. Так было подтверждено, что мутация deh является полудоминантной, а направление скрещивания не влияет на проявление аномалии у гибридов. Коэффициент вариации числа продуктивных узлов у мутантов deh в большинстве случаев превышает 20%. Можно ожидать, что селекционная работа с признаком ДТР, определяемым мутацией deh, будет затруднена, а преимущества использования такого типа роста доступны лишь в узком диапазоне условий. 6. Генетический контроль числа цветков в пазушном соцветии у гороха Наблюдения первого года реализации проекта относительно генетического контроля числа цветков в пазушном соцветии у гороха были дополнены новыми данными. Описаны гибриды F1 и F2 от скрещиваний «Люпиноид» × ДТР и «Штамбовый» × ДТР. Полученные результаты подтверждают вывод о том, что число цветков в пазушной кисти контролируется двумя генами, взаимодействующими по типу доминантного эпистаза: расщепление в F2 достоверно соответствует 13:3. Результаты оформлены в виде публикации. | ||
3 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Структурно-функциональный анализ генов, контролирующих активность апикальной меристемы побега у гороха посевного (Pisum sativum L.) и родственных бобовых |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".