Новые лазерно-оптические методы исследования живых системНИР

New

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
5 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа: Проведена экспериментальная проверка предложенных на предыдущем этапе теоретически методов решения прямой и обратной задачи дифракции лазерных пучков на клетках крови и моделирующих их оптических неоднородностях, случайным образом расположенных на монослоях и в разбавленных суспензиях. Удалось таким образом построить схему регистрации дифракционных картин и подобрать регистрирующие элементы, чтобы минимизировать шумовую компоненту и максимизировать точность определения линий изоинтенсивности с привязкой абсолютного значения их уровней к интенсивности в нуле, существенно расширив при этом динамический диапазон измерений. Проведены измерения на мазках крови человека (здоровых доноров и пациентов, страдающим диабетом и гипертензией), а также на крови малых лабораторных животных (крыс) с экспериментально вызванными теми же заболеваниями. Зарегистрированы существенные различия в параметрах дифракционных картин. По результатам экспериментальной проверки предложенных методов и алгоритмов подана заявка на патент. Проведены комплексные лазерно-оптические исследования механизмов взаимодействия углеродных наночастиц (наноалмазов) разных размеров с белками системы крови человека и крыс (альбумином и гемоглобином). В чпстности исследовано взаимодействие наноалмазных пленок с белковыми пленками, образующимися в результате высыхания растворов. Показана возможность самопроизвольной кристаллизации белка при высыхании раствора на поверхности наноалмазной пленки. Методом КР-спектроскопии установлено, что при взаимодействии с наноалмазной пленкой вторичная структура, структура дисульфидных мостиков и тирозинового дублета белка не меняются по сравнению с этими элементами его структуры в лиофилизованном состоянии, по крайней мере, в объеме белковой пленки толщиной 1 мкм. Тем не менее конформационные изменения могут иметь место в достаточно тонком приповерхностном слое пленки белка (порядка 20 нм). Проводилось комплексное исследование эффектов изменения параметров спонтанной агрегации и сдвиговой дисагрегации, а также деформируемости красных клеток крови при таких социально значимых заболеваниях, как гипертензия и диабет. Измерения проводились в цельной крови человека и крыс, в аутологичной плазме и в модельных растворах белков плазмы крови и других макромолекул с использованием двухканального лазерного пинцета, методов дифрактометрии (эктацитометрии) и диффузного рассеянная света (агрегометрии). Показано наличие существенных изменений микрореологических характеристик, вызванных этими заболеваниями. Изучалась зависимость аыявленных эффектов от тяжести заболеваний, возраста пациентов и наличия сопутствующих заболеваний.
6 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа: С помощью лазерных пинцетов проведены серийные измерения силы взаимодействия эритроцитов в плазме крови и в растворах нейтральных макромолекул (широко используемых в клинических исследованиях). Изучена температурная зависимость и показано, что сила взаимодействия эритроцитов при комнатной температуре (25 С) и при близкой к физиологической температуре (38 С) практически не отличаются для процесса спонтанной агрегации, характеризующей скорость образования агрегатов. В то же время для процесса вынужденной дезагрегации эритроцитов, характеризующей прочность агрегата, при понижении температуры наблюдается усиление взаимодействия примерно на 30%. Разработана и опробована методика для нахождения корреляции измерений агрегации эритроцитов на уровне индивидуальных клеток, проводимых с помощью лазерного пинцета, и на ансамбле клеток, проводимых по методу агрегометрии обратного рассеяния света от пробы цельной крови. Сдвиговые напряжения необходимые для остановки спонтанной агрегации эритроцитов, измеренные с помощью лазерных пинцетов на агрегате из двух клеток, количественно совпадают с результатами измерения тех же сдвиговых напряжений на цельной крови с помощью агрегометра. Эти результаты показывают перспективу использования результатов измерений на уровне индивидуальных клеток для изучения взаимодействия клеток в цельной крови и наоборот. По результатам измерений с помощью лазерных пинцетов, оценены энергии взаимодействия эритроцитов и предложены модификации модели, описывающие эти взаимодействия. Впервые получена зависимость энергии взаимодействия эритроцитов от стадии процесса спонтанной агрегации и вынужденной дезагрегации эритроцитов. При этом наблюдалась отличная зависимость, описываемая в первом случае осмотическими силами, во втором случае силами адсорбции макромолекул. Эти результаты позволят существенно продвинуться в понимании биомеханики взаимодействия эритроцитов. Результаты исследования опубликованы в статье: "Probing the red blood cells aggregating 
force with optical tweezers", Lee K., Danilina A.V., Kinnunen M., Priezzhev A.V., Meglinski I. в журнале IEEE JOURNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS, с. 7000106; DOI: 10.1109/JSTQE.2015.2477396. Продолжены исследования характера влияния различных наночастиц на компоненты крови и кровеносные сосуды при внутривенном введении наночастиц в кровь лабораторных животных с точки зрения нанотоксикологии и нанобезопасности, а также эффективности их возможного использования в будущем как платформы для клинической биомедицинской визуализации и направленного транспорта лекарств при лечении социально значимых заболеваний человека. В экспериментах, выполненных на КР-микроспектрофлюориметре in vitro, показано, что при адсорбции молекул одного из важнейших белков плазмы крови - альбумина их вторичная структура претерпевает изменения, степень которых зависит от концнентрации наночастиц в растворе и от характера функционализации его поверхности Результаты исследования опубликованы в статье: "Raman microspectroscopy of nanodiamond-induced structural changes in albumin" Svetlakova A.S., Brandt N.N., Priezzhev A.V., Chikishev A.Yu. в журнале JBO, 20(4), с. 047004 (2015), http://dx.doi.org/10.1117/1.JBO.20.4.047004. Также полученные результаты доложены на 5-ом "Сибирском семинаре по спектроскопии комбинационного рассеяния света" - доклад "КР спектроскопия в задаче взаимодействия алмазных наночастиц с альбумином", Брандт Н.Н., Логвина Е.В., Приезжев А.В., Чикишев А.Ю. Тезисы опубликованы в сборнике Пятый "Сибирский семинар по спектроскопии комбинационного рассеяния света", место издания Институт автоматики и электрометрии, Новосибирск, тезисы, с. 47-48. Впервые построена динамическая модель молекулярного мотора «динеина», работающего в стохастическом режиме. Она представляют собой систему двух связанных уравнений типа ФитцХью-Нагумо, работающих в триггерном режиме. Полиномы, описывающие силовые моменты, близки к N-образной форме. Параметры моделей определяются из функциональных схем моторов, построенных на основе экспериментов с применением рентгеноструктурного анализа, криогенной электронной микроскопии, лазерных пинцетов и скоростных методов видеомикроскопии с использованием «квантовых точек» (меток). Другое представление модели дается в виде систем обобщенных уравнений Релея. Были использованы данные экспериментов с применением лазерных пинцентов и светящихся флюоресцирующих меткок (квантовых точек) из работ группы D.Vale ( см. S.L. Reck-Peterson et al. Motile Properties of Cytoplasmic Dynein. // Handbook of Dynein, Pan Stanford Publishing, 2012, 145-171. Модель хорошо соответствует данным этих экспериментов. Результаты работы были доложены на V съезде биофизиков России (2015) в пленарном приглашенном докладе «ДИНАМИКА И ЭНЕРГЕТИКА ВНУТРИНЕЙРОННОГО ТРАНСПОРТА» Романовским Ю.М. Тезисы опубликованы в сборнике V Съезд биофизиков России. Материалы докладов. 4-10 октября 2015 г. Ростов-на-Дону, Изд-во ЮФУ (Ростов н/Д), том 1, с. 43-43. Совместно с сотрудниками ФФМ МГУ исследованы микрогемореологические изменения в крови больных сахарным диабетом первого (СД1) и второго (СД2) типов, а также у пациентов, страдающих акромегалией. С помощью лазерного агрегометра-деформометра (LADE, RheoMedLab, Россия) оценивали способность эритроцитов образовывать агрегаты и кинетику их дезагрегации. Образование крупных агрегатов, их максимальная гидродинамическая прочность и максимальный индекс деформируемости эритроцитов были одинаковым во всех трех группах. Однако при СД2 значимо ниже оказалась внутренняя вязкость эритроцита, а жёсткость мембраны была выше, чем в двух других группах. Эритроциты при СД хуже деформируются, что может влиять на движение крови в микроциркуляторном русле и приводить к микроангиопатиям. Обнаружено, что СД1 характеризуется замедленным образованием и незатруднённым распадом линейных агрегатов, но быстрым образованием трехмерных агрегатов, которые распадаются с трудом. С-пептид приводил к значимому снижению скорости образования монетных столбиков и повышению общей гидродинамической прочности агрегатов. Экспериментально воспроизводили на крысах модели ишемического инсульта и сахарного диабета. Микрогемореологические параметры изучались при экспериментальной фокальной ишемии головного мозга у крыс путём введения аутологичного, заранее приготовленного тромба. При отсутствии существенных изменений деформируемости эритроцитов, наблюдалось изменение скорости образования и прочности их агрегатов. По результатам сделан приглашенный доклад "Optical Assessment of Blood Microrheology in Norm, Disease and at Interaction with Nanoparticles (Invited)", Priezzhev A.V., Lugovtsov A.E., Nikitin S.Yu, Lee K., Ustinov V.D., Fadyukov O.E., Lin M.D., Koshelev V.B., Gurfinkel Yu I., Kinnunen M., Cheng C.L., Perevedentseva E.V., Karmenyan A.V. на конференции: 3rd International conference “BioPhotonics 2015”, Florence, Italy, May 20-22, 2015. Technical Program, p. 5, место издания Florence, Italy, тезисы, с. 5-5
7 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа: Реферат В соответствии с техническим заданием и целью проекта работа велась в направлении разработки новых лазерно-оптических методов исследования живых систем для применения в фундаментальных исследованиях и в практической медицине при диагностике и лечении таких социально значимых заболеваний, как гипертензия, сахарный диабет и сердечно-сосудистая недостаточность. На основе применения разработанных лазерно-оптических методов, появилась возможность измерения различных параметров на молекулярном, клеточном и организменном уровнях, а также построены математические модели строения и функционирования различных биоструктур, проведены численные расчёты и анализ статистической значимости получаемых результатов. Обозначения и сокращения Социально значимые заболевания – заболевания, которыми страдают значительная и постоянно возрастающая часть населения большинства стран мира и являющиеся одной из основных причин смертности населения. Эритроцит - красная клетка крови, ИДЭ – индекс деформируемости эритроцитов, как количественная оценка их способности к изменению формы под действием сдвиговых напряжений в потоке, ГТ – гипертензия, СД - сахарный диабет, ССН - сердечно-сосудистая недостаточность, АЭ - агрегации эритроцитов, ДЭ - дезагрегации эритроцитов, In vitro - вне организма, In vivo - в живом организме. Fa - сила агрегации двух изначально невзаимодействующих клеток с образованием дуплета, Fd - сила дезагрегации, необходимой для разъединения клеток и разрушения дуплета. K = Da/DV – коэффициент ремоделирования капилляра, как отношение диаметров его артериального и венозного отделов. Периваскулярная зона – чётко визуализируемая с помощью капилляроскопа область окружающей терминальный капилляр ткани, с которой идёт преимущественный обмен веществом, переносимым с кровью. Введение Спецификой данной НИР является междисциплинарный подход и комплексное применение методов, основанных на регистрации рассеяния и поглощения света, а также поляризационных, интерференционных и дифракционных явлений в результате взаимодействия лазерного излучения и биологических объектов. Другой особенностью данной НИР является сочетание фундаментального исследования и прикладной направленности разрабатываемых методов для биомедицинских применений. Более конкретно основными объектами исследования были цельная кровь и/или её отдельные компоненты in vitro и кровь, текущая по микрососуду (капилляру) in vivo. Другим классом исследованных объектов были молекулярные моторы, выполняющие различную работу в живых клетках. Основная часть 1. Были разработаны новые лазерно-оптические методы исследования механизмов взаимодействия компонентов крови друг с другом, а также с окружающим их потоком и сосудами в норме и патологии. Разработка велась в трёх приближениях: 1) в высоконцентрированной суспензии взаимодействующих компонентов – клеток и молекул плазмы крови (цельной крови) in vitro, 2) в сильно разбавленной суспензии эритроцитов с различными молекулярными компонентами, растворенными в окружающей клетке среде in vitro, и 3) в капиллярном кровотоке in vivo. 1.1. В первом случае взаимодействия клеток крови описывалось характерными временами спонтанной АЭ и сдвиговой ДЭ, которые измерялись по кинетике изменения интенсивности диффузного рассеяния от образца крови [ 1 ]. Было показано, что: 1) эти параметры отличаются у клеток разного возраста в одном и том же организме; они отличаются в пробах крови, взятых у людей разного возраста; их отклонение от нормы по-разному проявляется для исследованных заболеваний. 1.2. Во втором случае взаимодействия красных клеток крови оценивалось по значениям силы Fa и скорости агрегации (наползания друг на друга) и силы дезагрегации Fd, измеряемым с помощью лазерных пинцетов [ 2,3 ]. Было впервые обнаружено, что Fd > Fa, причём отношение этих величин существенно различно в крови здоровых доноров и пациентов, болеющих СД [ 4 ] . Кроме этого, в сильно разбавленных суспензиях эритроцитов измерялся ИДЭ по результатам обработки дифракционных картин [ 5 ]. На основе решения обратной оптической задачи с использованием нестандартных подходов к регуляризации разработан новый метод и алгоритм, защищённые патентом [ 6 ], позволяющие оценивать не только средние значения этого параметра по популяции, но и первые три момента распределения эритроцитов по деформируемости. 1.3. В третьем случае разрабатывались методы повышения эффективности визуализации кровеносных капилляров ногтевого ложа человека с определением распределения их по поверхности эпонихия, параметров тока крови в различных разделах капилляров, диаметров артериального и венозного отделов капилляров и размера периваскулярной зоны [ 7 ]. Было установлено, в частности, что при развитии СД происходит разрежение капиллярной сети и ремоделирование капилляров, выражающееся в сильном снижении значения К. 2. Были исследованы распределения свойств и значений параметров эритроцитов в норме и патологии. Измерения проводились путём измерения параметров картин дифракции при малоугловом рассеянии лазерного пучка на сухих и влажных мазках крови здоровых доноров и пациентов с ГТ, ССН и СД. Показано, что распределение по размерам клеток крови здоровых и больных людей отличаются [ 8 ]. 3. Были построены новые математические модели молекулярных моторов, работающих в присутствии тепловых шумов. В частности, рассмотрены молекулярные шагающие моторы: кинезин, миозин V и динеин, выполняющие различную работу в живых клетках [ 9 ]. В нейронах они обеспечивают транспорт нейромедиаторов и, таким образом, являются необходимыми компонентами взаимодействия 100 млрд клеток головного мозга. Рассмотрены функциональные схемы этих моторов и построены соответствующие математические модели. Модели представляют собой систему двух связанных уравнений типа ФитцХью—Нагумо. Однако описывающие силовые моменты полиномы высокого порядка близки к N-образной форме. Параметры моделей определяются из функциональных схем моторов, построенных на основе экспериментов с применением рентгеноструктурного анализа, криогенной электронной микроскопии, лазерных пинцетов и скоростных методов видеомикроскопии с использованием "точечных" меток. Сделаны оценки энергетики нейрона. Заключение Междисциплинарный подход и комплексное применение различных физических (главным образом лазерно-оптических) методов, а также методов математической физики и математического моделирования позволил нам существенно продвинуться в отработке новых подходов к измерениям параметров живых клеток, характеризующих наличие и степень тяжести ряда социально значимых заболеваний, а также в объяснении фундаментальных аспектов функционирования живых клеток и их отдельных компонентов.
8 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа:
9 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа: 1. Исследованы механизмы взаимодействия эритроцитов при их агрегации и дезагрегации в различных средах с помощью разрабатываемых нами оптических методик. Проведен статистический анализ данных, получаемых на образцах крови здоровых доноров и пациентов, страдающих артериальной гипертензией и сердечной-сосудистой недостаточностью. 2. Разработаны новые методы измерения с помощью лазерных пинцетов скорости образования парных агрегатов при взаимодействии одиночных эритроцитов в различных средах. Исследованы явления синергизма влияния различных белков плазмы крови на параметры агрегации эритроцитов 3. Разработаны новые методы измерения распределений эритроцитов по размерам и по способности к изменению своей формы (деформируемости) в сдвиговых потоках. Разработан и построен первый вариант макета портативного эритро-дифрактометра потенциально с более широкими возможностями по сравнению с известными аналогами.
10 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа: Разработаны новые методы измерения микрореологических параметров крови в норме и при различных социально-значимых заболеваниях на уровне больших популяций и одиночных клеток in vitro с применением методов диффузного рассеяния, дифрактометрии и лазерных пинцетов. В частности разработаны новые методы измерения с помощью лазерных пинцетов скорости образования парных агрегатов при взаимодействии одиночных эритроцитов в различных средах. Исследованы явления синергизма влияния различных белков плазмы крови на параметры агрегации эритроцитов. Разработаны новые методы измерения распределений эритроцитов по размерам и по способности к изменению своей формы (деформируемости) в сдвиговых потоках. Разработан и построен макет портативного эритро-дифрактометра с более широкими возможностями по сравнению с известными аналогами. С использованием разработанных методов исследованы изменения микрореологических характеристик крови у больных с таким социально-значимым заболеванием, как артериальная гипертензия.
11 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа:
12 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа:
13 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа:
14 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Новые лазерно-оптические методы исследования живых систем
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".