ИСТИНА

1. На культуре эндотелиальных клеток линии EA.hy926 были оценены токсическое и провоспалительное действие ФНО. Не удалось обнаружить провоспалительное действие гипергликемии и продуктов гликирования белков. В качестве основной клеточной модели для изучения воспалительного ответа эндотелия были выбраны клетки EA.hy926. Эти клетки получены в результате слияния клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) с клетками карциномы А549. Эти клетки сохраняют морфологические свойства эндотелия и, в частности структуру цитоскелета и межклеточных контактов, а так же экспрессируют многие поверхностные маркеры эндотелия. В то же время, эти клетки хорошо культивируются в стандартных средах и сохраняют свой фенотип на протяжении многих поколений. Клетки EA.hy926 образуют плотный монослой, что позволяет исследовать в этой модели изменения проницаемости эндотелия. Основные эксперименты проводились на монослое этих клеток после достижения конфлюэнтности. Наиболее важные результаты, полученные на клетках EA.hy926, затем были повторены на культуре HUVEC. Для индукции воспалительного ответа использовался рекомбинантный фактор некроза опухолей (ФНО) человека, который был любезно предоставлен Л.Н. Шингаровой (ИБХ РАН). В концентрациях выше 10 нг/мл ФНО вызывал гибель клеток, которая через 24-48 часов обработки имела все морфологические признаки апоптоза: конденсация хроматина, дробление ядер, блеббинг плазматической мембраны. Количественную оценку апоптоза проводили методом цитофлуориметрии после окрашивания ДНК иодистым пропидием по накоплению клеток со сниженным содержанием ДНК (пик SubG1). Биохимические признаки апоптоза: расщепление каспаз -8, -9 и -3, выход из митохондрий цитохрома с, а так же расщепление PARP оценивали методом иммуноблоттинга через 5-12 часов после обработки ФНО. Оценка общей жизнеспособности клеток показала, что максимальный токсический эффект ФНО (45%) достигался при концентрации 50нг/мл, дальнейшее повышение концентрации цитокина не приводило к снижению жизнеспособности клеток. При концентрациях ФНО ниже 10 нг/мл гибели клеток не наблюдалось (не наблюдалось увеличения числа клеток с раздробленными/конденсированными ядрами, или проницаемой плазматической мембраной и увеличения пика subG1). Таким образом, концентрацию ФНО ниже 10нг/мл считали не токсичной. Оценка про-воспалительного действия ФНО показала, что в не токсичных концентрациях он стимулировал способность монослоя клеток EA.hy926 связывать на своей поверхности нейтрофилы HL-60 (оптимальное время обработки - 8 часов). Этот эффект коррелировал с повышением экспрессии основного белка адгезии ICAM1. ФНО усиливал как экспрессию мРНК ICAM1 (оптимальное время обработки - 4 часа), так и накопление белка на поверхности (оптимальное время обработки - 8 часов). Интересно, что экспрессия другого белка адгезии ICAM2 снижалась под действием ФНО и такой эффект наблюдался ранее в некоторых других клеточных моделях. ФНО индуцировал секрецию провоспалительных цитокинов - интерлекинов 6 и 8 (оптимальное время обработки - 8 часов), которую регистрировали в культуральной среде методом иммуноферментного анализа (ELISA). Более длительная (48 часов) обработка ФНО приводила к повышению проницаемости монослоя эндотелия для высокомолекулярных соединений (для оценки использовали декстран-ТРИТЦ с молекулярным весом 65-85 кДа). Одновременно методами флуоресцентной микроскопии с использованием фалоидин-ТРИТЦ и специфических антител к белкам адгезионных межклеточных контактов наблюдались разборка кольцевого пучка актина и межклеточных контактов. Оценка экспрессии мРНК VE-кадгерина не выявила заметных изменений, в то время как иммуноблоттинг показал значительное снижение содержания этого белка в клетках. Эти результаты указывали на то, что ФНО стимулирует протеолиз VE-кадгерина в нашей модели. Наиболее вероятным механизмом протеолиза VE-кадгерина в данном случае является его расщепление металлопротеазами внеклеточного матрикса с образованием внеклеточного фрагмента. Действительно с помощью иммуноблоттинга мы наблюдали накопление в среде продукта расщепления VE-кадгерина. Другой важный белок межклеточных контактов, бета-катенин, также исчезал из зоны контактов, и, в некоторых клетках обнаруживался в ядрах. Известно, что этот белок обладает способностью регулировать транскрипцию многих генов, перемещаясь в ядро. Во всех проведенных тестах максимальный эффект ФНО наблюдался при его наибольшей не токсической концентрации (10нг/мл). В дальнейшей работе для исследования возможных противовоспалительных свойств разобщителей мы использовали ФНО в концентрациях, вызывающих не максимальную активацию клеток, а увеличение измеряемых параметров не более чем в 10 раз: 0,25 нг/мл для оценки мРНК ICAM1, 1 нг/мл для оценки экспрессии белка ICAM1 на поверхности и секреции интерлейкинов, 5 нг/мл для оценки адгезии нейтрофилов, перестроек цитоскелета, расщепления VE-кадгерина и повышения проницаемости монослоя. Стандартное культивирование клеток EA.hy926 и HUVEC проводилось в среде DMEM, содержащей 25мМ глюкозы. Повышение концентрации глюкозы в этой среде до 50 -60 мМ не вызывало заметных изменений морфологии клеток и не сопровождалось провоспалительным ответом, подобным тому, что наблюдался в случае ФНО. Более высокие концентрации глюкозы были токсичны. Измерения уровня АФК не выявили заметного окислительного стресса при 50-60 мМ глюкозы, а при повышении ее концентрации до 70 мМ наблюдалась тенденция к снижению уровня АФК (Рис. 1. Здесь и далее даны ссылки на рисунки в приложении 2). Мы сделали попытку перевести клетки эндотелия на среду с содержанием глюкозы, соответствующим физиологическим значениям - 5,5мМ, однако обе клеточные культуры быстро теряли жизнеспособность в этих условиях. Аналогичная процедура была проведена на клетках пигментного эпителия ARPE-19, которые сохраняли жизнеспособность в среде со сниженной концентрацией глюкозы. Последующий перенос этих клеток на среду с 50-70 мМ глюкозы также не вызвал достоверного повышения уровня АФК . Для дальнейшего изучения возможного провоспалительного действия гипергликемии были получены продукты глюкирования бычьего сывороточного альбумина (AGE-BSA). В литературе имеются данные о том, что эти молекулы связываются со специфическими рецепторами (RAGE) на поверхности клеток эндотелия и вызывают в них провоспалительный ответ. Для получения AGE-BSA в раствор, содержащий 1,6 мМ глюкозы и 3 мМ азида натрия, добавляли BSA до концентрации 100 мг\мл, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и инкубировали в термостате при 37ОС в течение 8 недель. После этого раствор трижды диализовали и снова фильтровали. Наличие модификаций было подтверждено анализом AGE-BSA в полиакриламидном геле. Добавка AGE-BSA (0,2 – 1,5 мг/мл) к клеткам EA.hy926, вопреки ожиданиям, не вызвало окислительного стресса, а при максимальной концентрации AGE-BSA наблюдалось заметное снижение уровня АФК. Еще более значительное снижение АФК наблюдалось при добавке немодифицированного BSA (1,5 мг/мл) (Рис. 2). Мы предположили, что BSA блокирует действие каких-то про-оксидантных компонентов среды и повторили эксперимент в среде, лишенной сыворотки. В этих условиях исходный уровень АФК был повышен, а AGE-BSA значительно снижал его уже в концентрациях 0,2 -0,8 мМ. При концентрации 1,5 мг/мл как AGE-BSA, так и немодифицированный BSA снижали уровень АФК примерно на 75%. Таким образом, нам не удалось воспроизвести литературные данные (Sena et al, 2013) по действию глюкированных белков на уровень АФК в клетках эндотелия. Мы решили проверить действие глюкированного BSA на клетках пигментного эпителия ARPE-19, которые культивировали при концентрации глюкозы (5,5 мМ), типичной для внутренней среды организма. Результаты оказались сходны с теми, что были получены на EA.hy926, хотя и не столь выраженными (Рис.3). На следующем этапе работы мы исследовали действие AGE-BSA на активацию клеток эндотелия EA.hy926. Активацию эндотелия определяли, измеряя экспрессию мРНК молекул клеточной адгезии ICAM1 и ICAM2. В качестве положительного контроля мы использовали ФНО в концентрации 5 нг/мл. Было показано, что, в отличие от ФНО, AGE-BSA не стимулируют экспрессию молекул адгезии (Рис. 4). Можно предполагать, что клетки линии EA.hy926 утратили способность реагировать на AGE-BSA, так как потеряли соответствующие рецепторы или другие компоненты сигнального пути от AGE. Мы сочли нецелесообразным проведение опытов по воздействию AGE-BSA на проницаемость монослоя этих клеток. Исследование действия AGE-BSA на клетки HUVEC пока не завершено. 2. Исследованы защитные эффекты разобщителей окислительного фосфорилирования и антиоксидантов при цитотоксическом и провоспалительном действии ФНО. Для изучения роли функционального состояния митохондрий при цитотоксическом действии ФНО, было исследовано действие разобщителей окислительного фосфорилирования, а также веществ, обладающих помимо разобщающей активности антиоксидантными свойствами. В опытах с традиционными разобщителями окислительного фосфорилирования (FCCP, TTFB и ДНФ), а также с катионными разобщителями (С12ТРР, С12R1 и C4R1), мы не обнаружили статистически значимого противо-апоптотического действия этих соединений. При этом, в отдельных опытах, при длительной (6 суток) преинкубации клеток с низкими концентрациями C12TPP (0,2нМ), мы наблюдали тенденцию к подавлению ФНО-индуцированного апоптоза. Для изучения роли АФК в цитотоксическом действии ФНО было исследовано защитное действие как традиционных, так и митохондриально-направленных антиоксидантов. Были выбраны соединения SkQ1 (пластохинонил-додецилтрифенилфосфоний ), SkQBerb (пластохинонил-додецилберберин) и SkQR1 (пластохинонил-додецилродамин-19). Для этих соединений ранее была показана высокая селективность по отношению к митохондриям, разобщающая и антиоксидантная активности. Преинкубация клеток с SkQ1 и SkQBerb в концентрации 20 нМ, а так же с SkQR1 в концентрации 2 нМ предотвращали апоптоз (Рис. 5). Традиционные антиоксиданты N-ацетилцистеин (5 мМ) и Тролокс (0,2 мМ) обладали аналогичным защитным действием. Интересно, что SkQ1, SkQBerb и SkQR1 не ингибировали начальные этапы ФНО-зависимого апоптоза, в частности, не влияли на активацию каспазы-8 и расщепление белка Bid. В то же время эти антиоксиданты предотвращали последующий выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и активацию каспазы-3. Таким образом, мишенью их защитного действия являлись компоненты митохондрий, ответственные за передачу сигнала апоптоза. Мы также оценили действие разобщителей окислительного фосфорилирования на стимулированную ФНО (0,25нг/мл, 4 часа) экспрессию мРНК ICAM1. Было показано, что преинкубация клеток в течение 4 дней с ДНФ (1-5 мкМ); TTFB (0,1 мкМ); а также C12TPP, С12R1 и C4R1 (0,2-20нМ), приводила к подавлению экспрессии мРНК ICAM1 примерно в два раза (Рис. 6). В более низких концентрациях разобщители были не эффективны, в концентрациях выше указанных были либо токсичны (ДНФ, C12TPP), либо вызывали обратный эффект (TTFB). Наиболее эффективными оказались концентрации 5 мкМ для ДНФ 0,1мкМ для TTFB и 2 нМ для C12TPP, С12R1 и C4R1. В этих же условиях разобщители вызывали снижение вызванной ФНО (5 нг/мл) экспрессии белка ICAM1 на поверхности клеток и адгезии нейтрофилов к поверхности монослоя эндотелия (Рис. 7). Разобщители частично предотвращали изменения структуры актинового цитоскелета и адгезионных межклеточных контактов, вызванные ФНО (5 нг/мл). Деградация VE-кадгерина так же была частично подавлена. Одновременно разобщители предотвращали ФНО-зависимое повышение проницаемость монослоя эндотелия для декстрана-TRITC. Кратковременная (15 минут - 4 часа) преинкубация клеток с ДНФ (3-5 мкМ) также приводила к подавлению вызванной ФНО экспрессии ICAM1. Двух часов преинкубации оказалось достаточно для достижения максимальной эффективности действия ДНФ. Четырехчасовая преинкубация клеток с 5мкМ ДНФ также заметно снижала деградацию VE-кадгерина вызванную ФНО (5 нг/мл, 24 часа). При кратковременной (2-4 часа) преинкубации клеток с C12TPP (0,2-20нМ) также наблюдалась тенденция к подавлению вызванной ФНО экспрессии ICAM1 и деградации VE-кадгерина. Меньшая эффективность С12ТРР в этих опытах могла быть связана с более медленным накоплением этого соединения в клетках. Результаты, полученные в опытах с кратковременной преинкубацией, указывают на то, что подавление вызванной ФНО активации клеток может быть результатом прямого действия частичного разобщения. Тот факт, что аналогичным действием в данной модели обладали антиоксиданты (в том числе митохондриально-направленные) позволяет предполагать, что действие разобщителей связано с торможением образования активных форм кислорода (АФК) в митохондриях. После длительной (4 дня) инкубации, удаление разобщителей за 12 часов до добавки ФНО никак не влияла на их способность подавлять стимулированную ФНО активацию эндотелия. Эти результаты указывали на то, что действие разобщителей могло быть связано с их способностью стимуляции митофагии и биогенеза митохондрий, а также иных защитных систем клетки. Мы проанализировали влияние разобщителей на содержание в клетках аутофагосом , используя специфические флуоресцентные красители (монодансилкадаверин и Cyto-ID) и вестерн-блот с антителами к маркеру аутофагосом белку LC3. Было обнаружено значительное увеличение количества аутофагосом, но лишь под действием очень высоких концентраций разобщителей. При концентрациях, ингибировавших действие ФНО, количество аутофагосом не увеличивалось. При одновременном окрашивании митохондрий мы не наблюдали их заметной колокализации с аутофагосомами, так что митофагия в этих условиях не выявлялась. Мы исследовали содержание митохондрий в клетках, измеряя методом ПЦР в реальном времени содержание митохондриальной ДНК. Этот метод не выявил значительного изменения содержания митохондрий при длительной инкубации с разобщителями (Рис. 8). Таким образом, ни митофагия, ни усиленный биогенез митохондрий, по-видимому, не определяли защитное действие разобщителей. С другой стороны, нельзя было исключать возможности одновременного усиления биогенеза митохондрий и митофагии и, как следствие ускорения цикла обновления пула митохондрий. В соответствии с планом работ мы начали исследовать влияние ФНО и разобщителей на морфологию митохондриального ретикулума в клетках EAhy926. Было обнаружено, что в клетках EAhy926, образующих конфлюэнтный монослой, большая часть митохондрий имеют извитую форму, а также имеется выраженная популяция сильно раздробленных митохондрий. Используя комбинацию MitoTracker Green (окрашивающего все митохондрии) и TMRM (накапливающегося в митохондриях с высоким мембранным потенциалом), мы показали, что раздробленные митохондрии в значительной мере деполяризованы. Обработка клеток ФНО (от 1 до 10нг/мл в течение суток) не вызывала заметных изменений морфологии митохондриального ретикулума. Длительная (4 дня) обработка клеток ДНФ (5мкМ) приводила к некоторому уменьшению фракции раздробленных митохондрий, но имеющихся данных пока не достаточно для окончательных заключений. Основные результаты, полученные на линии клеток EAhy926, были воспроизведены на первичной культуре эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). Было показано, что разобщители C12TPP (0,2нМ, 4 дня) и ДНФ (5 мкМ, 4 дня) подавляют стимулированную ФНО (0,25нг/мл, 4 часа) экспрессию молекул адгезии ICAM1, E-селектина (Рис 9). Аналогичные эффекты наблюдались для митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 (2 нМ) и традиционных антиоксидантов N-ацетилцистеина (5 мМ) и Тролокса (0,2 мМ). Удаление разобщителей при смене среды за 12 часов до добавки ФНО никак не влияла на их способность подавлять стимулированную ФНО активацию эндотелия. Полученные результаты указывают на то, что механизмы защитного действия разобщителей в клетках нормального эндотелия и в клетках линии EA.hy926 в основном совпадают. 3. На культуре эндотелиальных клеток было определено действие разобщителей окислительного фосфорилирования на мембранный потенциал митохондрий. Для измерения мембранного потенциала митохондрий был использован метод проточной цитометрии с использованием потенциал-зависимого зонда TMRM. Было показано, что ФНО в нетоксических концентрациях (1-10нг/мл) не оказывал заметного действия на поляризацию митохондрий. Эффективность традиционных разобщителей снижается в ряду FCCP > TTFB > ДНФ, причем более узкий диапазон разобщающих концентраций характерен для более эффективных разобщителей. Концентрационная зависимость действия С12ТРР имела выраженный двухфазный характер. В диапазоне 0,1-100 нМ наблюдалось плавное небольшое (не более 10%) снижение потенциала, а в диапазоне 200-1000 нм происходило резкое падение потенциала (Рис. 10). Аналогичные зависимости эффекта от концентрации наблюдались для С12R1 и C4R1. SkQ1 также вызывал снижение потенциала при концентрациях выше 500 нМ, но его эффект был выражен слабее. Двухфазный характер действия катионных соединений можно объяснить их потенциал-зависимым накоплением в митохондриях. Снижение мембранного потенциала должно снижать эффективность действия этих разобщителей и этот механизм ограничивает их эффективность. При высоких концентрациях этих соединений, возможно, реализуется иной потенциал-независимый механизм разобщения. Концентрации разобщителей, обладавшие максимальным защитным действием вызывали лишь незначительное (менее 10%) снижение мембранного потенциала. Частичное («мягкое») разобщение под действием катионных разобщителей не сопровождалось полным прекращением окислительного фосфорилирования. Этот вывод основан на том, что олигомицин (специфический ингибитор АТФсинтазы) повышал мембранный потенциал, сниженный на 7-10% в присутствии С12ТРР и SkQ1 (Рис. 11).

1. На клетках эндотелия линии EA.hy926 отработана модель для изучения воспалительного повреждения эндотелия. Показано, что фактор некроза опухолей (ФНО) стимулировал экспрессию мРНК молекул адгезии ICAM1, увеличивал экспозицию молекул ICAM1 на поверхности клеток и повышал адгезию нейтрофилов к монослою эндотелия. ФНО также нарушал структуру адгезионных межклеточных контактов и стимулировал протеолитическое расщепление VE-кадгерина. Повреждение контактов сопровождалось повышением проницаемости монослоя для макромолекул. На клетках линии EA.hy926 мы не обнаружили прооксидантного и провоспалительного действия гипергликемии и продуктов глюкирования альбумина. 2. Было исследовано действие митохондриальных разобщителей и митохондриально-направленных антиоксидантов на повреждение эндотелия, вызванное фактором некроза опухоли (ФНО). Показано, что митохондриальные разобщители не предотвращали гибель клеток эндотелия, вызванную ФНО. Однако, SkQ1 (пластохинонил-децилтрифенилфосфоний) и SkQBerb (пластохинонил-децилберберин) ингибировали апоптоз клеток EA.hy926, вызванный ФНО. Полученные данные позволяют заключить, что митохондриальные АФК играют важную роль в развитии воспалительного повреждения эндотелия. 3. На клетках эндотелия EA.hy926 и HUVEC было показано, что и митохондриальные разобщители, и митохондриально-направленные антиоксиданты эффективно предотвращают вызванную ФНО воспалительную активацию эндотелия, а именно: повышение экспрессии ICAM1, VCAM и E-селектина, секрецию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8, а также адгезию нейтрофилов к монослою эндотелия. 4. Определен эффект традиционных разобщителей (ДНФ, FCCP, TTFB) и катионных разобщителей (С12ТРР, С12R1, C4R1) на мембранный потенциал митохондрий в клетках линии EAhy926. Показано, что, в отличие от традиционных разобщителей, концентрационная зависимость действия С12ТРР, С12R1 и C4R1 имеет выраженный двухфазный характер. За небольшим (около 10%) снижением потенциала при концентрациях от 0,1нМ до 100нМ следует резкое падение потенциала при 200 – 1000 нМ. В широком диапазоне концентраций С12ТРР (0,1 – 20 нМ) наблюдается эффект «мягкого» разобщения без значительного снижения окислительного фосфорилирования. Предполагается, что снижение мембранного потенциала вызывает уменьшение накопления катионных разобщителей в митохондриях, что снижает эффективность их разобщающего действия.