ИСТИНА

Настоящий проект направлен на изучение терапевтического эффекта интраназального введения синтетических пептидов - неструктурированных фрагментов рецептора AGE на мышиной модели нейродегенерации альцгеймеровского типа. Рецептор конечных продуктов неферментативного гликирования (RAGE) участвует в транспорте амилоида-бета (Абета) с поверхности мембран внутрь клетки. С другой стороны, при отсутствии трансмембранного домена RAGE, связываясь с Абета, может усилить транспорт последнего из мозга в кровь и способствовать очистке мозга, что важно для терапии болезни Альцгеймера. Основное внимание будет уделено вопросу, восстановит/улучшит ли какой-либо из фрагментов RAGE память и как это отразится на функции митохондрий, энергетическом балансе мозговых клеток, снизит ли уровень активации микроглии и выделения провоспалительных итокинов. Планируется синтез отобранных неструктурированных фрагментов белка RAGE, их нтраназальное введение с последующим изучением поведения, энергетического етаболизма, митохондриальных функций, цитокинового статуса воспалительного процесса как в целом мозге, так и отдельно в коре и гиппокампе. Исследования будут проводиться на ольфакторно бульбэктомированных (ОБЭ) мышах, демонстрирующих основные признаки нейродегенерации альцгеймеровского типа, в том числе, резкое ухудшение памяти, повышение уровня бета-амилоида в головном мозге, дефицит серотонин- и ацетилхолинэргических систем, нарушения митохондриальных функций, гибель нейронов в коре и гиппокампе, в структурах, ответственных за процессы обучения и памяти. Нами планируется сравнительное изучение биоэнергетических характеристик митохондрий, таких, как активность окислительного фосфорилирования, комплексов дыхательной цепи митохондрий I и IV, окислительный стресс, а также уровень провоспалительных цитокинов IL-1alpha, IL-1beta, TNF и редокс-ферментов HO-1 и MnSOD до и после интраназального введения синтетических фрагментов RAGE. При положительном эффекте на воспалительный статус и энергетический метаболизм в коре и гиппокампе мозга ОБЭ мышей данное исследование будет значительным шагом вперед для понимания патогенеза болезни Альцгеймера и для разработки новых методов лечения.

This project is aimed at studying the therapeutic effect of the intranasal administration of synthetic peptides - unstructured fragments of the AGE receptor on the mouse model of Alzheimer's neurodegeneration. The non-enzymatic glycation end product (RAGE) receptor participates in the transport of amyloid-beta (Abeta) from the surface of the membranes into the cell. On the other hand, in the absence of a transmembrane domain, RAGE, by binding to Abeta, can enhance the transport of the latter from the brain to the bloodstream and help purify the brain, which is important for the treatment of Alzheimer's disease. The main attention will be paid to the question whether any of the fragments of RAGE memory will be restored / improved and how this will affect the functions of mitochondria, the energy balance of brain cells, whether the level of activation of microglia and the release of pro-inflammatory cytokines will decrease. It is planned to synthesize the selected unstructured fragments of the RAGE protein, their intranasal administration followed by the study of the behavior, energy metabolism, mitochondrial functions, cytokine status of the inflammatory process both in the whole brain and separately in the cortex and hippocampus. Studies will be conducted on olfactory bulbectomized (OBE) mice demonstrating the main signs of Alzheimer's neurodegeneration, including a sharp memory impairment, an increase in amyloid beta in the brain, a deficiency of serotonin and acetylcholinergic systems, a violation of mitochondrial functions, the death of neurons in the cortex and the hippocampus, in the structures responsible for learning and memory processes. We are planning a comparative study of the bioenergetic characteristics of mitochondria, such as oxidative phosphorylation activity, mitochondrial I and IV respiratory chain complexes, oxidative stress, and the level of proinflammatory cytokines IL-1alpha, IL-1beta, TNF and HO-1 and MnSOD redox enzymes up to and after intranasal administration of synthetic RAGE fragments. With a positive effect on inflammatory status and energy metabolism in the cerebral cortex and hippocampus of the OBE brain brain, this study will be a significant step forward for understanding the pathogenesis of Alzheimer's disease and for developing new treatments.

Нами планируется изучение энергетического метаболизма и уровня воспаления в клетках коры и гиппокампа в животной модели БА при интраназальном введении пептидов, являющихся синтетическими фрагментами RAGE - рецептора запуска сигнальных каскадов. Нам предстоит ответить на вопрос, действительно будет улучшение пространственной памяти и обучения у ОБЭ мышей при интраназальном введении пептидных фрагментов RAGE. При положительном эффекте лечения очень важно будет находить прямые корреляции с биохимическими процессами, вовлеченными в патогенез БА. Предполагается, что некоторые фрагменты RAGE рецептора могут восстанавливать/улучшать не только оперативную память животных, но и количество и качество митохондрий, а также снижать воспалительный статус в мозговых клетках. Нам предстоит провести комплексное изучение митохондриальных функций при развитии возможного терапевтического эффекта, отвечая на вопрос, действительно ли улучшение памяти и обучения сопровождается восстановлением ферментативных комплексов дыхательной цепи I и IV, улучшением энергетических характеристик митохондрий, включая скорость дыхания, мембранный потенциал, сопряженность мембран, или эти процессы могут проходить независимо друг от друга. Будет проведен анализ причинно-следственной связи уровня экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов при БА и эффектов фрагментов RAGE у ОБЭ мышей по сравнению с ЛО. В результате выполнения проекта будет определено относительное количество митохондриальной и ядерной ДНК в коре и гиппокампе ЛО, ОБЭ и леченых животных. По уровню экспрессии соответствующих мРНК будут определены концентрации основных провоспалительных цитокинов в тканях мозга: IL-1alpha IL-1beta, TNF; а также редокс-ферментов HO-1 и MnSOD. Планируется изучение окислительного стресса в митохондриях и в клетках мозга по содержанию малоногого диальдегида у ЛО, ОБЭ и ОБЭ мышей после 21-дневного курса интраназального введения пептидов RAGE. Измерение активности цитоплазматических ферментов антиоксидантной защиты, таких, как супероксиддисмутаза (суммарный SOD), каталаза (CAT), глутатионпероксидаза (Gpx), в клетках неокортекса и гиппокампа у 3-х групп животных биохимическими методами позволит оценить уровень антиоксидантной защиты нейронов. Сопоставление данных окислительного стресса в митохондриях и цитоплазме, полученных разными методами, биохимическими и методом ПЦР в реальном времени, ответит на поставленный вопрос. Будет проведен анализ причинно-следственной связи уровня экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов при БА у ОБЭ мышей по сравнению с ЛО.

Предполагаемое исследование носит комплексный характер и находится на стыке нейрохимии, молекулярной биологии и физиологии. Поэтому коллектив авторов состоит из разных специалистов, включая биохимиков, физиологов высшей нервной деятельности, морфолога, химика-синтетика. Коллектив в основном сформировался 3 года назад и успешно работает над выполнением проекта, поддержанного Грантом РФФИ №13-04-00982. У коллектива имеется большой опыт работы по всем тем методам и подходам, которые изложены в пунктах 2 и 3 настоящего проекта. Участниками проекта из Института биофизики клетки РАН в Пущино была разработана валидная животная модель спорадической формы болезни Альцгеймера на ольфакторно булльбэктомированных(ОБЭ)животных. В течение последних десяти лет их усилия были направлены на выяснение vолекулярно-клеточных механизмов возникновения нейродегенерации альцгеймеровского типа и сопряженных нарушений когнитивных процессов. У ОБЭ мышей развивается целый ряд поведенческих, морфологических и биохимических признаков, сходных с наблюдаемыми при БА. Общепринятые модели трансгенных животных больше соответствуют генетически-обусловленной, фамильной форме БА, которая составляет не более 5% случаев БА у людей. Уникальной особенностью данной модели является не только возможность исследовать механизмы развитие патологии на самых ранних ее этапах, но и использовать эту модель для выявления эффективных фармакологических препаратов и других подходов для терапии БА.

Патогенез болезни Альцгеймера (БА) сопровождается дисфункцией митохондрий и воспалением в мозговых клетках. Нами изучены митохондриальные нарушения и воспалительный статус в клетках неокортекса и гиппокампа ольфакторно бульбэктомированных (ОБЭ) мышей линии NMRI, которые служили адекватной моделью спорадической формы БА. Для терапии БА и восстановления указанных нарушений нами были использованы синтетические пептиды к фрагментам рецептора конечных продуктов гликилирования RAGE, повторяющие его экспонированные неструктурированные участки. Цитотоксический амилоид-бета (Абета) является лигандом RAGE, с его помощью транспортируется через гематоэнцефалический барьер и накапливается в мозге. Связывание Абета с рецептором RAGE на мембране глиальных клеток приводит к активации микроглии и воспалительному ответу в виде выделения провоспалительных цитокинов, таких, как интерлейкин-1альфа (IL-1a), интерлейкин-1бета (IL-1b), фактор некроза опухоли (TNFa). С другой стороны, растворимая форма sRAGE (без трансмембранного домена), синтезирующаяся в нейронах, связывается с Абета и способствует её выносу в кровяное русло, очищая мозг от патогенных лигандов. Аналогичным действием обладают короткие синтетические пептиды – фрагменты RAGE, предположительно моделирующие сайты связывания Абета на эктодомене рецептора, терапевтическое действие которых и является предметом исследования данного проекта. Сравнительное изучение биоэнергетических характеристик митохондрий, таких, как активность комплексов дыхательной цепи, мембранный потенциал, до и после интраназального введения 4-х синтетических фрагментов RAGE выявил отчетливый терапевтический эффект некоторых из них. Изолированные из неокортекса и гиппокампа ОБЭ мышей митохондрии демонстрировали значительное падение активности комплексов I и IV электрон-транспортной цепи, которое было предотвращено 3-я пептидами при интраназальном введении в течение 21 дня. Несмотря на восстановление митохондриальных функций только один из пептидов, а именно фрагмент RAGE (60-76), улучшил пространственную память ОБЭ мышей, а ещё один короткий пептид – фрагмент RAGE (60-62) не оказывал никакого эффекта ни на память, ни на активность дыхательных комплексов. Таким образом, восстановление энергетического метаболизма является необходимым, но недостаточным условием для предотвращения/лечения нейродегенерации в данной модели БА. На следующем этапе исследований был проведен анализ уровня экспрессии соответствующих мРНК основных провоспалительных цитокинов (IL-1а, IL-1b, TNFа) и редокс-ферментов (HO-1 и MnSOD) в тканях мозга (коре и гиппокампе) животных. Динамика экспрессии мРНК на 10-й, 20-й и 30-й день после операции показала, что уровень экспрессии всех цитокинов и редокс-фермента HO-1 в неокортексе ОБЭ мышей больше по сравнению с аналогичными пробами из ЛО мышей, с максимумом эффекта на 20-й день. В то же время, в гиппокампе ОБЭ животных было обнаружено статистически достоверное увеличение только мРНК IL-1b на 20-й день. Таким образом, дальнейшие эксперименты по анализу терапевтического действия фрагментов RAGE на воспалительный статус мозга целесообразно проводить на 20-й день после операции в неокортексе. Измерение относительного содержания мтДНК показало его снижение в неокортексе и, напротив, увеличение в гипплкампе ОБЭ животных на всех послеоперационных сроках.