ИСТИНА

Циклический транспорт электронов через фотосистему 1 является одним из адаптивных механизмов, выработанных клетками фотосинтезирующих организмов для эффективной утилизации световой энергии. В этом процессе электроны поступают в электрон-транспортную цепь тилакоидной мембраны от растворимых цитоплазматических восстановителей - NADPH и ферредоксина. Некоторые структурные компоненты цепей циклического транспорта электронов идентифицированы, однако остается неясной природа целого ряда его составляющих. Целью проекта является исследование генетического контроля и регуляции циклического транспорта электронов через фотосистему 1 у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Для решения поставленной задачи будет применен комплексный подход с использованием современных методов молекулярной генетики, биофизики и биохимии. Проект предусматривает создание коллекции мутантов Synechocystis sp. PCC 6803 с нарушением NADPH-зависимого и ферредоксин-зависимых путей циклического транспорта электронов. Эффективность транспорта электронов через фотосистему 1 будет оцениваться методом ЭПР-спектроскопии путем сравнения скоростей послесветового восстановления реакционного центра фотосистемы 1 (P700+) в клетках мутантов и дикого типа в физиологических и стрессовых условиях, а также с помощью модельных экспериментов на изолированных тилакоидных мембранах цианобактерии с применением NADPH, ферредоксина, различных ингибиторов электронного транспорта и ряда белковых продуктов цианобактериальных генов, экспрессированных в клетках E. coli. Проектом предусмотрено конструирование мутантов цианобактерии, несущих гистидин-кодирующие последовательности ДНК в составе ряда генов, контролирующих NADPH-зависимый транспорт электронов, и очистка белковых продуктов с целью идентификации компонентов белковых комплексов, участвующих в циклическом транспорте. Полученные данные позволят расширить современные представления о механизмах и регуляции транспорта электронов у фотосинтезирующих организмов и будут использованы при моделировании процессов электронного транспорта в тилакоидной мембране цианобактерий.

Цель проекта - изучение регуляции циклического фотосинтетического транспорта электронов через фотосистему I (ФСI) у фотогетеротрофной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 и поиск новых генов, контролирующих этот процесс. Создана коллекция из 58 мутантов Synechocystis sp. PCC 6803, имеющих нарушения на отдельных или множественных этапах фотосинтетического или дыхательного транспорта электронов. Для оценки способности клеток цианобактерии осуществлять циклический транспорт электронов через ФСI измерены скорости восстановления окисленного светом реакционного центра ФСI (P700+) в присутствии ингибитора ФСII диурона в интактных клетках дикого типа и мутантов. Показано, что активация циклического транспорта электронов через ФСI в тилакоидной мембране цианобактерии может быть вызвана снижением уровня конечных акцепторов электронов от ФСI (NADP+ или кислорода), а также снижением активности нециклического транспорта электронов в результате повреждения фикобилисом, отсутствия каротиноидного белка ОСР, обеспечивающего диссипацию излишка поглощаемой световой энергии, или нарушения процесса димеризации ФСII. Cкорость послесветового восстановления Р700+ возрастала при добавлении глюкозы, а также в адаптированных к соли клетках цианобактерии. Основной вклад в восстановление Р700+ в адаптированных к 0,5 M NaCl клетках вносит зависимый от ферредоксина циклический транспорт электронов через ФСI, контролируемый генами slr1208/ssr2016. Ускорение послесветового восстановления Р700+ в присутствии глюкозы связано с поступлением электронов от NADPH через дыхательную электрон-транспортную цепь тилакоидной мембраны, а также с усилением ферредоксин-зависимого циклического транспорта электронов при снижении уровня конечного акцептора электронов от ФСI (NADP+). Проведен мутационный анализ гена drgA Synechocystis sp. PCC 6803, кодирующего растворимую NAD(P)H:хинон-оксидоредуктазу, участвующую в переносе электронов от NADPH в пул пластохинона тилакоидной мембраны. На основе анализа информационной структуры белка DrgA сконструированы и экспрессированы в клетках E. coli делеционные варианты гена drgА. С использованием спонтанных и УФ-индуцированных устойчивых к диносебу мутантов цианобактерии идентифицированы мутации, нарушающие функцию белка DrgA. В модельных экспериментах на изолированных тилакоидных мембранах Synechocystis sp. PCC 6803 показано, что экспрессированный в E. coli и очищенный белок DrgA в присутствии NADPH ускоряет послесветовое восстановление P700+. Делеция аминокислотных остатков в положении 147-171 белка DrgA приводила к потере NAD(P)H:хинон-редуктазной и NAD(P)H:диносеб-редуктазной активностей и утрате способности белка участвовать в темновом восстановлении Р700+. Полученные данные показывают, что активный центр белка DrgA может располагаться в районе 147-171 аминокислотных остатков. В изолированных препаратах ферредоксин может передавать электроны в электрон-транспортную цепь тилакоидной мембраны в отсутствие как slr1208/ssr2016-зависимого, так и NAD(P)H-зависимого путей циклического транспорта.