ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Методами стационарной кинетики in vitro охарактеризовать связывание тиамина и производных с митохондриальными дегидрогеназами 2-оксокислот, способное регулировать активность in vivo. Определить изменения пула тиамина и активностей дегидрогеназ 2-оксокислот в животных моделях различных (пато)физиологических условий. Для достоверного сопоставления изменений в метаболизме, пуле тиамина и активностях дегидрогеназ 2-оксокислот в (пато)физиологических условиях определить метаболические изменения в мозге, сопряженные с изменениями пула тиамина и дегидрогеназ. Сопоставить обнаруженный на первом этапе работы антистрессорный эффект регуляции ОГДК сукцинилфосфонатом (при воздействии этанола и/или гипоксии беременных) с наблюдающимися при этих стрессах изменениями в пуле тиамина. С учетом полученных данных провести эксперименты по возможной коррекции возникающих изменений в тиамин-зависимой системе нервной ткани путем воздействия изученных регуляторов in situ и in vivo.
Для характеристики молекулярных механизмов действия витамина В1 (тиамина) и его производных в нервной ткани в данном проекте была разработана гипотеза о координированной регуляции метаболических и транспортных тиамин-зависимых процессов, существенных для синтеза нейромедиаторов и проведения сигнала в ЦНС. Впервые для животных систем были найдены условия, в которых изменяется уровень сигнального производного тиамина, тиаминтрифосфата (ТТФ) и показано регуляторное влияние этого производного на 2-оксоглутаратдегидрогеназу. Мы показали, что при хроническом алкоголизме крыс наблюдается достоверное двукратное снижение ТТФ в мозге и отсутствие изменений в других соединениях тиаминового пула вследствие увеличения как удерживания тиамина мозгом, так и синтеза в нем тиаминдифосфата (ТДФ). Полученные данные указывают на то, что терапевтическое воздействие тиамина на функции мозга и 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДК) при алкоголизме, обычно приписываемое восстановлению дефицита коферментной формы тиамина, тиаминдифосфата (ТДФ), на самом деле могут быть связаны с трифосфорилированным производным тиамина. В модели острой гипобарической гипоксии мы показали различия в пуле тиаминовых соединений в зависимости от анатомического отдела мозга и физиологического состояния животных. Известное увеличение чувствительности к гипоксии беременных крыс по сравнению с небеременными коррелировало с разницей в реакции тиаминового пула коры, мозжечка и ствола на гипоксию. Статистически достоверные отличия в локомоторной и ориентировочно исследовательской активности подвергшихся гипоксии животных указывают на то, что регистрируемые у таких животных изменения уровня тиаминовых соединений, ОГДК активности и метаболизма азота в мозге влияют на поведение. Можно предположить, что инициатором таких изменений является снижение уровня фосфорилирования ТДФ, вызываемое нарушением выработки АТФ вследствие гипоксии. Падение коферментной формы ТДФ может вести к снижению активности ОГДК. По нашим результатам о росте в этих условиях количества активного фермента можно предположить,что ингибирование ОГДК компенсируется мозгом за счет увеличения синтеза активного фермента или его посттрансляционных модификаций. Наблюдаемые пертурбации в этой точке пересечения метаболизма глюкозы и аминокислот сопряжены, в частности, с изменением гомеостаза нейромедиаторов и поведения животных, что может вызывать отдаленные негативные последствия у потомства. Получены данные по возможности коррекции возникающих изменений в тиамин-зависимой системе нервной ткани путем регуляции ОГДК и предложено использование в качестве терапевтического воздействия при гипоксии беременных тиамина (витамина В1).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2010 г. | Характеристика молекулярных механизмов действия витамина В1 и его производных на метаболизм и проведение сигнала в нервной ткани |
Результаты этапа: С целью изучения роли регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот тиамином и производными в функциях нервной ткани работа проводилась на уровнях in vivo, in vitro и in silico. In vivo, были начаты комплексные исследования по характеристике активности дегидрогеназ 2-оксокислот и состоянию пула тиамина в животных моделях с нарушениями таких функций. Показаны изменения активности дегидрогеназ 2-оксокислот мозга в условиях стресса (действие этанола и гипоксии), свидетельствующие о критическом значении этих узлов метаболизма в компенсации нарушений гомеостаза. Для характеристики тиаминового пула в мозговых экстрактах разработан новый метод анализа тиаминовых производных путем масс-спектрометрии. Для исследований регуляции комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот тиамином и производными in vitro были усовершенствованы методы получения мозговых комплексов, охарактеризован уровень эндогенного тиаминдифосфата (ТДФ) получаемых препаратов и подобраны условия обратимой диссоциации тиаминдифосфата с образованием апофермента 2-оксоглутаратдегидрогеназы в составе комплекса. Экспериментальные подходы дополнялись исследованиями in silico, использующими методы моделирования и биоинформатического анализа белковых структур. С помощью альтернативных подходов построены две модели холоферментного комплекса 2-оксоглутаратдегидрогеназы человека. В трехмерной структуре белка, построенной на основе апофермента бактериального гомолога, образование холоферментного комплекса моделировали путем докинга ТПФ. Альтернативный подход состоял в использовании в качестве матрицы для моделирования 2-оксоглутаратдегидрогеназы человека разрешенных структур холоферментых комплексов других представителей семейства ТДФ-связывающих ферментов. Полученные модели различаются конформациями ТДФ-связывающей области активных центров, причем одна их конформаций свидетельствует о возможности конкурентного в отношении ТДФ связывания тиаминтрифосфата в активном центре 2-оксоглутаратдегидрогеназы человека. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".