ИСТИНА

В рамках выполнения НИР предполагается разработать лабораторную установку для микробной переработки органических отходов (сточных вод пищевых предприятий, целлюлозосодержащих отходов и др.) в электроэнергию. В разрабатываемой установке будет реализован принцип работы МТЭ. Узким местом данной технологии, является участок взаимодействия микроорганизмов с анодным электродом, на который происходит передача электронов. В процессе выполнения НИР, будет подобран оптимальный вариант анодного электрода для МТЭ. Микробиологические продуценты будут выделены из природных биотопов. Затем, будут отобраны наиболее активные из них. Для них, в свою очередь, будут изучены: морфологические особенности, таксономический состав, электрохимические параметры и параметры культивирования. Результаты НИР должны будут внести существенный задел для дальнейшей ОКР по теме создания технологии переработки органических отходов и получения электроэнергии в микробном топливном элементе.

1. Подбор и испытание различных материалов анодного электрода. Конструкция и материал анодного электрода МТЭ имели принципиальное значение для работы системы в целом, поскольку именно на поверхности электрода, микроорганизмы взаимодействуют с электрохимической системой. Поэтому, одна из главных задач заключалась в выборе материала для создания анодного электрода. Ко всем материалам предъявлялось несколько основных требований: устойчивость по отношению к среде культивирования микроорганизмов, прочность и электропроводность материала. В прототипах МТЭ, разработанных нами были использованы как твёрдые электроды (графитовые и стеклоуглеродные), так и графитизированные ткани различной плотности. В качестве анодного электрода биоэлектрохимической ячейки были использованы, твёрдые графитовые электроды. Графитизированную ткань «Карбон (углеткань) 450 г/м твил 12К производства «БалЭнергоМаш», Россия применяли для создания лабораторного прототипа МТЭ (рис. 1; здесь и далее по тексту, все рисунки приведены в приложение к НТО). Использованная графитизированная ткань, коммерчески доступна и применяется для создания композитных материалов в авиации и автомобилестроении. На основе графитизированной ткани были сделаны электроды различной площади. Методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) было показано, что ткань состоит из прилегающих друг к другу волокон диаметром порядка 10 мкМ (рис. 2). Развитая площадь поверхности, а также прочность и устойчивость графитизированной ткани, позволяли использовать её в качестве электрода МТЭ, который будет колонизирован микроорганизмами. 2. Изучение возможности повышения эффективности переноса электронов от терминальной редуктазы ЭТЦ микроорганизма к аноду. Были изучены окислительно-восстановительные свойства биоплёнки микробного сообщества выделенного из ила минерального источника близ города Кисловоддска, на ранней стадии колонизации анодного электрода. В данном эксперементе, использовали сенсорный электрод, получаемый методом трафаретной печати (рис. 3). Для этого культивировали микробное сообщество в биоэлектрохимической ячейке работающей в режиме МТЭ в течение трёх дней. В электрическую цепь МТЭ был подключён только рабочий углеродный электрод сенсора. Затем заменяли среду культивирования в биоэлектрохимическуой ячейки на модельную, и проводили потенциометрический анализ, методом циклической вольтамперометрии. Как видно на рисунке 4 при потенциалах +212 и -240 мВ относительно стандартного водородного электрода (или -8 и -460 мВ относительно хлорсеребряного электрода), происходило значительное возрастание плотности тока на электроде (сила тока возрастала на 61 и 162,6 мкА соответственно). Известно, что при прямом переносе электронов роль терминального компонента мембранной ЭТЦ выполняет цитохром типа с. Вовлечение цитохромов типа с в прямой перенос электронов было доказано спектроскопическими и электрохимическими методами. Окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) солюбилизированных цитохромов OmcB и OmcZ расположенных в наружной мембране и относящихся к цитохромам типа с составляют -450 и -390 мВ относительно хлорсеребряного электрода. Эти цитохромы предположительно могут участвовать в реакции переноса электронов к нерастворимым терминальным акцепторам, таким как минеральные соединения (Fe2O3, Fe(OH)3 и др.) или к аноду МТЭ [1]. Пики в этих диапазонах ОВП были показаны также для биоплёнок электрохимически активного микроорганизма Geobacter sulfurreducens [2, 3]. Таким образом, можно предположить, что увеличение плотности тока на электроде, покрытом одноуровневой биоплёнкой микробного сообщества повышается за счёт того, что при потенциале -460 мВ, в окислительно-восстановительную реакцию вступает редуктаза из класса цитохромов с типа, локализованная, во внешней мембране клеточной стенки микроорганизма, в непосредственном контакте с электродом. Наиболее эффективно процесс передачи электрона от донора к акцептору происходит, в случае, если разность значений ОВП между анодным электродом и терминальным звеном ЭТЦ микроорганизма (терминальной редуктазой внешней мембраны клеточной стенки или электронным медиатором) составляет 50-100 мВ. То есть анодный электрод должен быть на 50-100 мВ положительнее терминального звена ЭТЦ [13]. Для того чтобы повысить интенсивность передачи электронов от клеток микроорганизмов к поверхности анодного электрода МТЭ, мы использовали анаэробную электрохимическую ячейку, способную также работать в режиме МТЭ, сконструированную на первом этапе НИР. В качестве рабочего электрода ячейки использовали графитовую пластину площадью 350 мм2, закреплённую на графитовом стержне с помощью электропроводного клея. В качестве вспомогательного электрода и электрода сравнения использовали стеклоуглеродный стержень и хлорсеребряный (Ag/AgCl-) электрод соответственно. Потенциал на рабочем электроде задавали с помощью потенциостата EmStat2 (Нидерланды). Потенциал устанавливали таким образом, чтобы он был на 100 мВ положительнее значения пика плотности тока полученного в процессе циклической вольтамперометрии биоплёнки микробного сообщества. В качестве контроля использовали электрод, погружённый в среду культивирования, в режиме разомкнутой цепи, т.е., на контрольном электроде ОВП искусственно не задавали. Было показано, что в процессе культивирования, микроорганизмы преимущественно колонизовали опытный электрод, это также коррелировало с увеличением плотности тока на опытном электроде. Возможность снизить энергетический барьер между терминальным компонентом ЭТЦ и поверхностью электрода, способствует тому, что реакция переноса электрона становится болоее энергетически выгодной для микроорганизма. Этот метод может позволить не только увеличить эффективность генерации энергии в МТЭ, но и повысить эффективность работы ЭТЦ микроорганизмов, тем самым, например, увеличить их метаболическую активность, что может в свою очередь сказаться на скорости потребления субстрата. Благодаря этому методу также можно избирательно накапливать на поверхности электрода микроорганизмы, которые несут на своей наружной мембране редуктазы, с определённым ОВП. Такое искусственное накопление можно осуществлять при запуске процесса переработки органического сырья в МТЭ. 3. Разработка наиболее оптимального дизайна МТЭ, с учётом массопереноса, конструкции, материалов и расположения анодного и катодного электродов. Далее, нами был разработан прототип МТЭ. Для этого использовали пластиковый контейнер объемом 500 мл с герметичной крышкой. Катодную камеру оборудовали на дне контейнера, куда засыпали гранулированный активированный уголь URC 12 * 30 тип А (производства CHEMVIRON CARBON) в качестве катода. Размер гранул угля 0,6 – 1,7 мм. Над слоем угля накладывали графитизированную ткань (углеткань 450 г/м твил 12К) прошитую графитовым волокном, выведенным к внешней клемме, представлявшую собой болт из нержавеющей стали. Длина графитизированной ткани для катодного электрода 11 см, ширина 7,5 см, что соответствует размеру ячейки. По краям ткань проклеивались клеем «Момент резиновый» (Henkel) во избежание расплетания нитей. Дно контейнера заранее перфорировали 77 отверстиями диаметром 0,5 см каждое. Отверстия были необходимы для доступа кислорода к катоду. Над катодной частью располагали анодную камеру. В качестве анода использовали графитизированную ткань, аналогичным образом прошитую проводником, выведенным к внешней клемме, интегрированную в крышку контейнера. Длина анодного электрода составила 33 см, ширина – 7,5 см. Анодное и катодное пространства разделяли диализной мембраной. Культивирование микроорганизмов проводили в анодной камере. Крышку контейнера оборудовали двумя отверстиями для интеграции электрода сравнения и отбора проб (рис. 5). Измерение генерируемой мощности осуществляли, используя амперметр, магазин сопротивлений, подключенные последовательно в цепь к электродам ячейки. За изменением потенциала наблюдали, используя параллельно подключенный мультиметр. Мощность рассчитывали по формуле для цепи постоянного тока: P = UI, где Р –мощность; U – напряжение в цепи; I – сила тока в цепи. На базе созданной конструкции проводили испытания по периодическому культивированию микроорганизмов, используя в качестве субстрата осветлённую фракцию послеспиртовой барды. Осветлённую барду получали сепарированием нативной барды. В конструкции МТЭ были предусмотрены все необходимые элементы, позволяющие увеличить эффективность процесса. Площадь анодного электрода была достаточно развитой, для того чтобы обеспечить необходимое обрастание биоплёнками. Площадь катода значительно превышала площадь анода, за счёт использования пористого активированного угля. Такое соотношение площадей исключало лимитирующее влияние катода. Минимальное расстояние между электродами, обеспечивало беспрепятственную диффузию протонов к катоду. Кроме того, благодаря тому, что катодная камера была расположена в нижней части МТЭ, происходило необходимое смачивание всей площади поверхности гранулированного угля. 4. Создание прототипа МТЭ для переработки послеспиртовой барды в электроэнергию. В сконструированном МТЭ культивировали отобранное сообщество микроорганизмов. В первые две недели культивирования, цепь между анодом и катодом была разомкнута. В этот период происходило падение ОВП на анодном электроде в область отрицательных значений. После того как значение ОВП на анодном электроде достигло –500 мВ, цепь замыкали. Сопротивление цепи варьировали в диапазоне от 0 до 100 кОм. Эту процедуру выполняли для поиска того напряжения, при котором бы фиксировалось максимальное значение электрической мощности. Максимальная мощность электрического тока в первый день после замыкания цепи (14-й день культивирования) составила 126 мкВт, при напряжении 140 мВ (рис. 6). Затем значение сопротивления цепи устанавливали на уровне 3 кОм и сохраняли его в течение семи дней, до следующего вольт-амперометрического измерения. Как видно на рисунке 6, значение электрической мощности возрастало в течение 56-ти дней культивирования, после чего выходило на плато. Максимальное значение мощности при этом составило порядка 501 мкВт (0,5 мВт), при ОВП 245 мВ. В дальнейшем, наблюдали резкое падение мощности, связанное, однако исключительно с нарушением целостности диализной мембраны разделяющей анодную и катодную камеру. Диализная мембрана, использованная нами в работе, содержала в своём составе целлюлозу и вследствие этого подвергалась ферментативной активности целлюлозолитических микроорганизмов, входящих в состав сообщества, среди которых были виды близкие роду Clostridium, идентифицированные молекулярно-биологическими методами. Однако, конструкция МТЭ, позволяла произвести быструю замену повреждённой мембраны. После выполнения этой процедуры максимальное значение мощности восстанавливалось в течение одной недели. Увеличение электрической мощности в период с 14-го по 56-ой дни культивирования также чётко коррелировало с падением ОВП на анодном электроде с +46 мВ до -200 мВ, соответственно. Эта зависимость свидетельствовала о том, что на аноде постепенно был сформирован устойчивый отрицательный ОВП. Его формирование сопровождалось ростом биоплёнок на поверхности анодного электрода. Методами оптической и электронной микроскопии была изучена динамика обрастания анодной графитизированной ткани. На рисунке 7 представлены микрофотографии полученные методом оптической флуоресцентной микроскопии, демонстрирующие постепенное обрастание единичных волокон анодного электрода. На рисунке 8 представлены микрофотографии полученные методом РЭМ, которые также демонстрировали обрастание клетками анодных волокон. Таким образом, после трех недель культивирования колонизация поверхности графитизированных волокон носила локальный характер. А спустя 8 недель культивирования уже можно было наблюдать плотные биоплёнки покрывающие волокна анодного электрода. Увеличение площади колонизированной биоплёнками поверхности и их плотности, коррелировало с падением анодного ОВП и ростом значения электрической мощности. Такая зависимость объясняется локальным накоплением микроорганизмов на поверхности анодного электрода, способных передавать электроны на анод МТЭ за счёт прямого контакта их терминальных редуктаз с электродом. При этом клетки, также входящие в состав биоплёнок, но не имеющие возможности осуществить прямой перенос электронов на анод, могли синтезировать метаболические вещества способные вступать в обратимые окислительно-восстановительные реакции и тем самым осуществлять медиаторный транспорт электронов. Вольтамперометрический анализ культуральной жидкости освобождённой от клеток центрифугированием, показал наличие пиков, косвенно подтверждающих присутствие таких веществ. Как видно на рисунке 9, было идентифицировано два пика резкого возрастания плотности тока при значениях ОВП 0 и +400 мВ относительно хлорсеребряного электрода электрода (-220 и +180 мВ относительно стандартного водородного электрода). Особенно интенсивное увеличение силы тока наблюдали при потенциале -220 мВ. Из литературы известно, что клетки электрогенного микроорганизма Shewanella. oneidensis MR-1 используют флавины как двух-электронные/протонные окислительно-восстановительные медиаторы [21]. ФМН + 2e− + 2H+ → ФМНH2. ОВП пары ФМН/ФМНН2 равен -220 мВ (относительно стандартного водородного электрода) [21]. Таким образом ОВП пары ФМН/ФМНН2 у электрогенного микроорганизма S. oneidensis MR-1, соответствует ОВП соединения выделяемого членами исследуемого микробного сообщества в среду культивирования. Таким образом, была показана способность однослойной микробной биоплёнки покрывающей электрод непосредственно вовлекаться в биоэлектрохимические реакции при перенапряжении -460 мВ относительно хлорсеребряного электрода, что вероятно свидетельствует о переносе электронов с терминальной редуктазы ЭТЦ, из класса цитохромов типа с, к поверхности электрода. Также была показана способность микробного сообщества синтезировать соединение, вовлекающееся в окислительно-восстановительные реакции при перенапряжении 0 мВ относительно хлорсеребряного электрода (-220 мВ относительно стандартного водородного электрода). Эти механизмы, вероятно интенсифицировались, в процессе культивирования микробного сообщества и оказывали непосредственное влияние на увеличение электрической мощности МТЭ до 501 мкВт. Для того чтобы увеличить напряжение в цепи и соответственно повысить электрическую мощность разработанной системы, 8 МТЭ были собраны в одну электрическую цепь, путём последовательного подключения (рис. 10). Во всех МТЭ культивировали ранее отобранное, электрохимически активное микробное сообщество в периодическом режиме. В качестве субстрата вносили осветлённую фракцию послеспиртовой барды. В течение первых двух недель культивирования батарея из 8-ми МТЭ находилась в разомкнутой цепи. Суммарное напряжение разомкнутой цепи батареи МТЭ составило 5,5 В. Затем цепь замыкали, в качестве нагрузки и наглядного сигнализатора работы системы, в цепь была интегрирован светодиод, который прекращал работать при нарушении целостности электрической цепи, который мог происходить в случае нарушения целостности диализной мембраны. Определение максимального значения электрической мощности проводили каждую неделю. Как видно на рисунке 11, значение максимума электрической мощности на 14-ый день культивирования составляло 920 мкВт (0,9 мВт), при перенапряжении 1691 мВ, в то время как на 35-й день культивирования значение мощности достигло 3553 мкВт (3,5 мВт), при напряжении 2393 мВ, после чего увеличение мощности более не наблюдали. Как и в случае с одной ячейкой, увеличение мощности батареи МТЭ объясняется падением ОВП на анодных электродах, вследствие увеличения плотности тока. В свою очередь плотность тока на анодах увеличивается за счёт постепенной колонизации электрода микроорганизмами. Благодаря этому происходило увеличение напряжения в системе из восьми МТЭ, которое можно наблюдать (рис. 11) в виде смещения максимума мощности от измерения к измерению по оси абсцисс, в сторону увеличения. Операционная стабильность разработанной системы включающей восемь последовательно подключённых в электрическую цепь МТЭ превысила 12 месяцев. Заключение В рамках НИР была разработана биоэлектрохимическая система, позволяющая преобразовывать энергию химических связей органического сырья в электрическую энергию. Был разработан метод, позволяющий осуществлять селективный отбор микроорганизмов несущих на внешних мембранах своих клеточных стенок терминальные компоненты ЭТЦ, участвующие в прямом переносе электронов от клетки к внешнему акцептору. В природе эти микроорганизмы широко распространены в анаэробных биотопах, в зонах электрохимических градиентов, в которых происходит постоянное поступление соединений окисленного железа и/или марганца, восстанавливаемых этими микроорганизмами. Используя разработанную нами методику можно производить селективный отбор этих микроорганизмов в накопительных системах для решения научных и прикладных задач. Сообщество микроорганизмов, отобранное нами из ила минерального источника, для культивирования в МТЭ включало 24 таксономические группы микроорганизмов, которые участвовали в комплексном процессе деструкции растворимой и нерастворимой органики осветлённой фракции послеспиртовой барды. Для восстановления оксидов железа и для передачи электронов на анодный электрод МТЭ, микроорганизмы, входящие в состав сообщества использовали как минимум два механизма. Во-первых, члены сообщества, были способны колонизировать поверхность анодного электрода, путём формирования на его поверхности плотных биоплёнок и во-вторых, они синтезировали соединения, которые могли быть вовлечены, в биоэлектрохимические реакции в роли посредников, переносящих электроны от терминальных редуктаз ЭТЦ к поверхности электрода. МТЭ разработанные нами, были способны генерировать напряжение в цепи между анодным и катодным электродом на протяжении более чем 12 месяцев, при этом используя в качестве источника углерода и энергии отход спиртопроизводственных предприятий. Впервые было применено инвертированное расположение анодной и катодной камер друг относительно друга. Такое расположение элементов МТЭ предусматривало минимальное расстояние между анодом и катодом. Мощность одного МТЭ составила 0,5 мВт. Мощность восьми МТЭ включённых в цепь последовательно составила 3,5 мВт. Литературные источники 1. Lovley D.R., Holmes D.E. and Nevin K.P. Dissimilatory Fe (III) and Mn (IV) reduction. Advances in Microbial Physiology. 2004. Vol. 49. P. 219- 287. 2. Katuri K.P., Kavanagh P., Rengaraj S., Leech D. Geobacter sulfurreducens biofilms developed under different growth conditions on glassy carbon electrodes: insights using cyclic voltammetry. Chemical Communications. 2010, Vol. 46. N. 26. 4758–4760. 3. Fricke K., Harnisch F., Schrçder U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy and Environmental Science. 2008. Vol. 1. 144–147. 4. Lapinsonnire L., Picot M., Barrire F. Enzymatic versus microbial bio-catalyzed electrodes in bio-electrochemical systems. ChemSusChem. 2012. Vol. 5. N. 6. P. 995–1005.