ИСТИНА

Проект посвящен получению и исследованию свойств нового поколения наноструктурированных многослойных сенсорных материалов. Отличительной особенностью таких материалов являются входящие в их состав новые полимерные объекты с нелинейной архитектурой (полиэлектролитные звезды, сферические и молекулярные полиэлектролитные щетки). Полученные с участием полимерных объектов с нелинейной архитектурой, а также разнообразных оксидоредуктаз, такие сенсорные материалы лягут в основу формирования биоаналитических платформ нового типа, что откроет возможность расширения спектра анализируемых соединений, а также позволит осуществить их одновременный анализ. Научно-техническое решение, предлагаемое в настоящем проекте, основано на применении технологии последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП) для формирования сенсорных покрытий, прочность взаимодействия слоев в которых обеспечивается множественными контактами ионогенных, а, в ряде случаев, и гидрофобных групп входящих в состав покрытия компонентов. Предлагаемая технология может быть использована для изготовления сенсорных элементов без ограничений по размеру и форме, существенно снижает уровень фоновых сигналов, снимает внутри диффузионные затруднения при реакции аналита с поверхностью сенсора. В данном проекте впервые предлагается использовать все преимущества универсальной технологии ПНП и уникальные свойства полиэлектролитов с нелинейной архитектурой для формирования многослойных сенсорных покрытий по типу ПНП. Данные полимерные объекты, благодаря своим свойствам и отличиям от линейных аналогов (в первую очередь, благодаря более высокой объемной плотности заряда и более «жесткой», не способной к существенным конформационным изменениям при адсорбции, топологической структуре, обуславливающими возможность эффективной перезарядки поверхности по сравнению с линейными аналогами), обладают значительным потенциалом для применения в нанотехнологии. Ожидаемое увеличение адсорбции целевых ферментов, более прочное их удерживание, а также усиление стабилизации многослойной конструкции в целом приведет к значительному увеличению уровней чувствительности и стабильности сенсорных покрытий. Высокая степень новизны получаемых в этой части работы результатов будет определяться уникальностью и новизной полимерных рецептур на основе полиэлектролитов нелинейной архитектуры, используемых для включения ферментов, а также применением самых современных методов изучения поверхности сенсорных элементов. Оптимизация технологического процесса получения наноструктурированных сенсорных покрытий нового типа предполагает 1) проведение систематического скрининга различных конструкций многослойных сенсорных покрытий; 2) проведение оценки эффективности способов подготовки поверхности сенсорных матриц и их дополнительной модификации; 3) получение информации о топографии наноструктурированных пленок, содержащих полимерные объекты с нелинейной архитектурой; 4) исследование аналитических характеристик конструкций многослойных сенсорных покрытий; 5) исследование стабильности и воспроизводимости конструкций многослойных сенсорных покрытий. Результатом выполнения проекта будет разработка прототипов биоаналитических платформ с использованием сенсорных материалов нового типа, на основе ферментов и полимерных объектов с нелинейной архитектурой. Будут сконструированы высокочувствительные, многослойные биосенсорные матрицы на основе тирозиназы, холиноксидазы и алкогольоксидазы, пригодные для детекции холина, фенола и этанола. Разработанные биосенсорные матрицы будут адаптированы к уже существующим, запатентованным моделям амперометрических анализаторов для анализа биологически активных соединений в растворах. Применение биоаналитических платформ данного типа для анализа ряда сериновых гидролаз позволит решить задачу эффективного анализа присутствия в окружающей среде токсичных химических агентов, являющихся ингибиторами вышеперечисленных эстераз, регистрации воздействия токсичных химических агентов на живые организмы (по анализу данных ферментов в доступных биологических объектах, таких как цельная кровь или плазма), а также позволит создать подходы к индивидуальной терапии лекарственными препаратами. Простота в использовании, компактность и низкая стоимость анализа, сенсорных матриц и электронного прибора позволит продвинуть продукт до индивидуального потребителя с целью быстрой диагностики и индивидуальной терапии. Аналогов предлагаемой разработки на данный момент в мире не существует. Постановка задачи полностью соответствует приоритетному направлению развития науки, технологий и техники в Российской федерации «Живые системы» и перечню критических технологий Российской Федерации в части разработки биокаталитических, биосинтетических и биосенсорных технологий. Данный проект базируется на результатах фундаментальных исследований физико-химических и биохимических свойств полиэлектролитов, биополимеров, наночастиц и комплексов с их участием (выполненных, в том числе, и в рамках проектов РФФИ 06-03-32696-а, 05-03-08165-офи-а, 05-04-08143-офи-а и 07-04-12235 офи. Быстрое внедрение разработанных в проекте сенсорных систем будет обеспечено за счет уже разработанных ранее прототипов биосенсорных систем для анализа широкого спектра ингибиторов холинэстераз, фенола, глюкозы, спирта. Созданные прототипы успешно прошли лабораторную апробацию на базе Химического факультета МГУ, Всероссийского центра молекулярной диагностики и лечения, Центра медико-экологических проблем и предприятиях, задействованных в процессе уничтожения химического оружия. Одиннадцать амперометрических анализаторов ингибиторов холинэстераз успешно прошли конкурсные испытания и были приняты в качестве приборов быстрого мониторинга в химико-бактериологических лабораториях водопроводных станций ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга». Эта серия анализаторов обеспечивала готовность упомянутых лабораторий в период проведения Саммита 8 государств в Санкт-Петербурге летом 2006 года в части анализа нейротоксинов в воде. Существующая научно-техническая кооперация между Химическим факультетом МГУ и производителями аналитического оборудования и сенсорных элементов (ООО «Аттометрикс») создает дополнительные условия для быстрого внедрения результатов выполнения проекта.

Проект направлен на получение и исследование свойств нового поколения наноструктурированных многослойных сенсорных материалов, полученных с участием полимерных объектов с нелинейной архитектурой (полиэлектролитные звезды, полиэлектролитные щетки), а также ряда оксидоредуктаз. В основе развиваемой технологии изготовления биосенсорных матриц лежит метод послойного нанесения полиэлектролитов (ПНП). Свойства фермент-полиэлектролитных пленок исследованы в зависимости от ряда факторов, отвечающих за формирование активных и стабильных сенсорных покрытий: типа поверхности, используемой для модификации; структуры и свойств полиэлектролитов; последовательности нанесения компонентов (послойная адсорбция отдельных компонентов и/или адсорбция предварительно образованных в растворе фермент-полиэлектролитных комплексов); условий нанесения компонентов (кинетика адсорбции компонентов, ионная сила раствора, присутствие низкомолекулярных анионов, присутствие органических растворителей и др.) Исследованы особенности формирования фермент-полиэлектролитных слоев на поверхностях двух типов: полированных графитовых стержней, а также на планарных графитовых сенсоров, изготавливаемые методом трафаретной печати. Показано, что характеристики поверхности, такие как, например, ее рельеф и шероховатость, (получено методом атомно-силовой микроскопии, АСМ), вносят существенный вклад в процесс последующей адсорбции компонентов и итоговую активность пленок. Для графитовых стержней показано, что использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры позволяет увеличить активность сенсорных покрытий, полученных по технологии ПНП для всех исследованных оксидаз (холиноксидазы, тирозиназы или алкогольоксидазы). Увеличение активности предположительно обусловлено увеличением количества адсорбируемого фермента, которое обеспечивается за счет особенностей строения полимеров нелинейной архитектуры, в частности наличия участков с повышенной плотностью заряда (например, ядра полиэлектролитных звезд). Исследована адсорбция линейных и звездообразных полиэлектролитов на поверхность графитового стержня в присутствии галогенидов калия. Обнаружено, что если адсорбция полимера проводится в присутствии KI, то наблюдается многократное увеличение активности пленок. Аналогичное влияние на активность пленок, но при более низких концентрациях, оказывают двух- или трехвалентные анионы. Методами турбидиметрии и динамического светорассеяния показано образование ассоциатов в растворах полимеров в присутствии вышеупомянутых анионов. Высказано предположение, что адсорбция полиэлектролита в виде ассоциатов, а не в виде отдельных молекул, приводит к увеличению эффективной площади поверхности и одновременно к увеличению на ней числа центров адсорбции для фермента, что приводит к увеличению активности пленок. Исследована адсорбция линейных и звездообразных полиэлектролитов и холиноксидазы на поверхность графитового стержня в присутствии 0-20% этанола. В отличие от солевых эффектов варьирование концентрации этанола на стадии адсорбции полиэлектролита вызывает некоторое увеличение активности пленок. При этом не обнаружено особых различий в поведении звездообразного и линейного объектов. Однако если концентрация этанола изменяется на стадии адсорбции холиноксидазы, то обнаружено, что с ростом концентрации этанола в системе активность конструкций, содержащих линейные полиэлекролиты, либо уменьшается, либо остается неизменной. В то же время активность всех конструкций, содержащих звездообразные полиэлектролиты, в тех же условиях значительно увеличивается. Методом квазиупругого светорассеяния доказано образование комплексов полимерных звезд с ферментами в растворе, изучена ферментативная активность комплексов различного состава в растворе, получены их ИК-спектры и исследована активность сенсорных покрытий, содержащих комплексы. Методом АСМ охарактеризована топография поверхности получаемых сенсорных покрытий. Показано наличие слабого взаимодействия между полимерными звездами и ферментами в водных растворах. При этом не наблюдается значительного изменения активности ферментов в растворе при образовании данных комплексов. Показано, что более плотная пленка на поверхности графитовых стержней, а также более активные сенсоры, образуются именно при послойном нанесении поликатионных звезд и ферментов, а не тогда, когда сначала в растворе формируется комплекс полиэлектролит-фермент, который затем наносится на поверхность методом ПНП. Оптимизированы процесссы формирования фермент-полиэлектролитных пленок с холиноксидазой и тирозиназой на поверхности планарных графитовых сенсоров. Обнаружено, что использование полимеров нелинейной топологии или солевых эффектов в этом случае не дает эффекта увеличения отклика. Возможно, это связано с большей исходной шероховатостью поверхности планарных электродов в отличие от графитовых стержней, поэтому на полимерные звезды сами по себе, и адсорбция полимеров в ассоциированном состоянии уже не привносят дополнительного разветвления поверхности. Отметим, что некоторый положительный эффект в активность пленок вносят полиэлектролиты с большей степенью полимеризации. Однако добавление этанола на стадии адсорбции полиэлектролита дало эффект увеличения отклика, хотя и несколько меньший, чем это наблюдалось в случае графитовых стержней. Исследована стабильность и аналитические характеристики получаемых сенсорных покрытий обоих типов. Возможности разработанных сенсоров (как стержневых, так и планарных) были продемонстрированы на примере биосенсорного определения индивидуальных эстераз АХЭ, БХЭ,КЭ и НТЭ в цельной крови человека и экспериментальных животных (крыс, мышей) с использованием эфиров холина и фенола в качестве субстратов эстераз и детекции холина и фенола при помощи холиноксидазных и тирозиназных сенсоров, соответственно. Для оценки правильности новых методов, биосенсорные измерения сравнивали со стандартными спектрофотометрическими методиками. Показано, что наблюдается хорошая корреляция между спектрофотометрическими и биосенсорными методами, что подтверждает верность биосенсорных измерений. Полученные результаты по активностям АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ в цельной крови хорошо соответствуют опубликованным данным. Отдельно показано, что данный подход можно распространить на биэлектродную сенсорную систему, которая представляет собой вариант объединения холинового и фенольного сенсоров для одновременного анализа каждого из аналитов. Данная система способна с высокой точностью одновременно измерять активности, по меньшей мере, двух ферментов, АХЭ и БХЭ, при таких низких концентрациях, как 3 ? 10-10 М. Эти результаты демонстрируют возможность использования биэлектродной сенсорной системы для определения в крови нескольких ферментов.