ИСТИНА

Интеграза ВИЧ-1 осуществляет одну из ключевых стадий репликативного цикла вируса - встраивание ДНК копии геномной РНК в геном инфицированной клетки. Интеграция осуществляется в два этапа: связав вирусную ДНК, интеграза катализирует реакцию 3’-процессинга, в результате которой с 3’-конца каждой цепи удаляется динуклеотид GT. Затем интеграза катализирует реакцию переноса цепи, при которой вирусная ДНК встраивается в ДНК зараженной клетки. Существует несколько типов низкомолекулярных ингибиторов интегразы, из которых основными являются ингибиторы 3’-процессинга и переноса цепи. Последние связываются с комплексом интегразы с вирусной ДНК и препятствуют связыванию клеточной ДНК. Все они хелатируют ион магния, связанный в активном центре ИН и участвующий в каталитической реакции. К этим ингибиторам быстро возникает устойчивость. Ингибиторы 3’-процессинга связываются в активном центре самой интегразы и препятствуют связыванию вирусной ДНК. Большинство из них оказываются неактивны in vivo. В этой связи проблема создания ингибиторов с новым механизмом действия является чрезвычайно актуальной. Настоящий проект направлен на исследование ингибиторов интегразы на основе олигомерных молекул: олигонуклеотидов, пептидов и др. Нами показано, что короткие модифицированные олигонуклеотиды являются эффективными ингибиторами интегразы. Способность ингибировать 3’-процессинг была обнаружена для олигомерных производных бензимидазола. Cотрудниками Центра изучения биохимии макромолекул НЦНИ (Франция) и Лаборатории биотехнологии и прикладной генетической фармакологии НЦНИ (Франция) созданы короткие пептиды, способные эффективно ингибировать интеграцию в культуре инфицированных клеток, однако их действие на саму интегразу еще не изучено. К настоящему моменту только для олигонуклеотидных ингибиторов исследован механизм действия по отношению к рекомбинантной интегразе. Показано, что ингибирование протекает по неконкурентному механизму, модифицированные олигонуклеотиды связываются с комплексом интегразы с субстратной ДНК и вызывают его разрушение. В проекте планируется исследовать механизм ингибирования интегразы пептидными ингибиторами и олигомерными производными бензимидазола и сравнить механизм действия этих соединений с олигонуклеотидными ингибиторами и несколькими низкомолекулярными ингибиторами интегразы. После этого планируется изучение механизма ингибирования вирусной репликации олигомерными ингибиторами в культуре клеток. Эта работа будет осуществлена в лаборатории биотехнологии и прикладной генетической фармакологии НЦНИ (Франция).

Интеграция ДНК вируса иммунодефицита человека в геном зараженной клетки является одной из ключевых стадий репликативного цикла этого вируса. В этой связи вирусный фермент интеграза, осуществляющий процесс интеграции, представляет большой интерес в качестве мишени для новых противовирусных препаратов. Существующие на настоящий момент низкомолекулярные ингибиторы интегразы обладают схожим механизмом действия, и к ним достаточно быстро вырабатывается устойчивость. В связи с быстрым возникновением лекарственно-устойчивых форм вируса, проблема создания ингибиторов интегразы с новым механизмом действия является чрезвычайно актуальной. В настоящей работе исследовалось ингибирование интегразы олигомерными соединениями трех классов: димерными бисбензимидазолами (ДБ), которые являются лиганды малой бороздки ДНК; пептидами и короткими модифицированными олигонуклеотидами. В первую очередь был детально исследован механизм ингибирования интеграции ДБ с различной структурой линкеров, соединяющих бисбенимидазольные фрагменты, и показано, что они взаимодействуют с интегразой и препятствуют правильной укладке ДНК в ее активном центре. При этом эффективность ингибирования существенно зависит от природы линкера. Исследовано влияние клеточного ко-фактора интегразы LEDGF/p75 на ингибирующую активность ДБ и установлено, что в присутствии LEDGF ингибирующее действие ДБ несколько ухудшается. Изучено воздействие на интегразу коротких пептидов различной природы. Впервые показано, что пептидный компонент, выделенный из гомогената морского червя Polychaeta, может ингибировать каталитическую активность ИН. Причем присутствие в 6-звенном пептиде необычной аминокислоты - гомосерина - значительно повышает его ингибирующее действие. Также изучены пептиды GTKWLTEVWPLC (PT12), GTKWLTEWIPLTAEC (PT15) и GTKWLTEWIPLTAEAEC (PT17), способные связываться с ИН ВИЧ-1. Показано, что один из пептидных ингибиторов способен подавлять каталитическую активность комплекса ИН в комплексе с LEDGF с IC50 = 25 мкМ. Детально исследовано действие на активность интегразы коротких одноцепочечных олигонуклеотидов разного состава и их конъюгатов с эозином. Показано, что при низких концентрациях олигонуклеотидов наблюдается эффект стимуляции активности интегразы, а увеличение концентрации олигонуклеотидов приводит к ингибированию фермента. На основании зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации ингибитора сделано заключение, что молекула интегразы имеет два независимых центра связывания одноцепочечного олигонуклеотида, связывание с одним из которых приводит к активации интегразы, а с другим – к ингибированию. Также показано, что присоединение к олигонуклеотиду остатка эозина не влияет на колоколообразный характер зависимости скорости процессинга от концентрации одноцепочечного олигонуклеотида, однако значительно снижает концентрации, при которых наблюдается ингибирование ИН. В результате, присоединение эозина к олигонуклеотиду значительно повышает его потенциал как ингибитора интеграции.