ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
С каждый годом число устойчивых бактериальных штаммов возрастает, в то же время темпы создания новых антимикробных препаратов снижаются. Бактериальные инфекции представляют угрозу не только для стран третьего мира, но и для развитых. В связи с ростом числа резистентных штаммов в ближайшие десятилетия смертность от бактериальных инфекций может возрасти в разы или даже десятки раз. В связи с этим крайне актуальным является задача поиска новых антибиотиков. Большинство известных антибиотиков действуют по трем механизмам: нарушение синтеза клеточной стенки, синтеза нуклеиновых кислот или синтез белка. Более половины известных антибиотиков нарушают синтез белка, несмотря на структурную схожесть бактериальной и эукариотической рибосом, удается обнаружить такие небольшие молекулы, которые специфически ингибируют работу бактериальной. Кроме очевидного практического применения ингибиторы трансляции помогают разобраться в фундаментальных основах функционирования рибосомы. Рибосома, один из самых сложных рибонуклеопротеидных комплексов в клетке, осуществляют синтез белка, за счет координации сразу многих процессов: декодирование, пептидилтрансферазная реакция, движение рибосомы по мРНК и т.д. Все эти стадии могут быть специфически остановлены под действием различных антибиотиков. Это позволило провести структурные и биохимические исследования рибосомы в переходных функциональных состояниях, дав уникальную информацию о механизме работы аппарата трансляции. Нами разработана уникальная система скрининга, позволяющая in vivo в высокопроизводительном режиме определять механизм действия антибиотика, одновременно с оценкой эффективности его действия. В ходе выполнения проекта планируется проанализировать не менее десяти тысяч индивидуальных химически синтезированных и природных соединений и отобрать те, которые подавляют рост бактериальных клеток за счет нарушения процесса синтеза белка. Одновременно с этим будет проводиться оптимизация молекул-лидеров (см. задел), обнаруженных нашей группой ранее, при выполнении договора о предоставлении субсидии Минобрнауки 14.607.21.0086 (окончание 31.12.2016) и продемонстрировавших ингибирование трансляции. В данном проекте планируется исследовать обнаруженные ингибиторы и их производные с помощью как биохимических, так и структурных методов, таких, как рентгеноструктурный анализ (РСА) и криоэлектронная микроскопия (криоЭМ). Структурные данные позволят проводить рациональную оптимизацию молекул, основываясь на их месте их связывания с бактериальной рибосомой. Оптимизированные молекулы будут проверены на клинически значимых штаммах и, возможно, могут быть использованы для создания новых антимикробных лекарств. В лаборатории профессора Вилсона, немецкого партнера данного проекта, налажен метод криоЭМ комплексов рибосома-антибиотик. В ходе реализации проекта, кроме изучения новых синтетических соединений, планируется исследовать такие природные антибиотики как миксоваларгин, эланзолид и апидацин. Структура комплекса данных ингибиторов трансляции с рибосомой не известна, однако, предварительные данные показали возможность использования метода криоЭМ для решения данной задачи.
With each year the number of resistant bacterial strains is increasing, at the same time the pace of development of new antimicrobials is reduced. Bacterial infections are a threat not only to the third world countries, but also for developed countries. Due to increasing number of resistant strains during last years, mortality from bacterial infections may increase at times or even dozens of times. So, the finding new antibiotics becomes very urgent task for molecular biology. Most of the known antibiotics act by three mechanisms: impaired cell wall synthesis, nucleic acid synthesis or protein synthesis. More than half of the known antibiotics disrupt translation, despite the structural similarity between the bacterial and eukaryotic ribosomes, it is possible to finf such small molecules that specifically inhibit bacterial translation. Apart from the obvious practical application, translation inhibitors help to understand the fundamentals of the functioning of the ribosome. Ribosome is one of the most difficult ribonucleoprotein complexes in the cell, the protein synthesis is carried out, by directly coordinating several processes: decoding, the peptidyl transferase reaction, translocation, etc. All these steps can be specifically stopped by antibiotics. It is possible to carry out structural and biochemical studies of the ribosome in the transition of functional states, obtaining unique information about the mechanism of translation. We have developed a unique screening system that allows in vivo in high throughput manner to determine the mechanism of antibiotic action, simultaneously with measuring the efficiency. During the project, it is planned to analyze at least ten thousand of individual chemically synthesized and natural compounds and to select those which inhibit the growth of bacterial cells by disrupting the protein synthesis process. At the same time the molecules leaders (see. preliminary work) discovered by our group earlier, when the contract for the Ministry of Education grants 14.607.21.0086 (ending 31.12.2016) and demonstrated inhibition of translation, will be optimized. In this project, it is planned to investigate the detected inhibitors and their derivatives using both biochemical and structural techniques such as x-ray crystallography (XRC) and Cryo-electron microscopy (Cryo EM). The structural data will allow to carry out a rational optimization of molecules, based on their place of binding to the bacterial ribosome. Optimized molecules will be tested on clinically significant strains and may be used to create new anti-microbial drugs. In Professor Wilson laboratory, the German partner of the project, Cryo EM of ribosome-antibiotic complexes is adjusted. During project, in addition to the study of new synthetic compounds, natural antibiotics myxovalargin, elansolid and apidaecin will be analisied. Structure of these translation inhibitors is not known, however, preliminary data showed the ability of Cryo EM using for solving this problem.
Будет проанализирована антибактериальная активность большого набора (не менее десяти тысяч) химически синтезированных соединений и природных соединений, продуктов метаболизма почвенных и других микроорганизмов и проведена их классификация по механизму действия. На данный момент разработанная нами репортерная система является наиболее эффективной по скорости проведения эксперимента и себестоимости, она позволяет детектировать антибиотики, действующие на рибосому, а также вызывающие повреждения ДНК. Найденные в ходе запланированного в рамках данного проекта скрининга, а также обнаруженные нами ранее, новые ингибиторы синтеза белка будут оптимизированы с целью повышения их эффективности и селективности. Для этого будут проведены комплексные структурные исследования методами РСА и криоЭМ. Для оптимизированных молекул будет оценена эффективность подавления роста набора клинически значимых бактериальных патогенов, а также токсичность по отношению к клеткам человека. Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых лекарств и подходов к лечению инфекционных заболеваний. Также будут определены структуры комплекса антибиотик-рибосома для набора интересных ингибиторов трансляции - миксоваларгина, эланзолида и апидацина, предварительные эксперименты уже показали возможность использования данного метода для решения поставленной задачи.Исследование новых ингибиторов рибосомы востребовано мировым научным сообществом. Структурно-функциональные исследования подобного рода публикуются в высокорейтинговых научных журналах (Bulkley D, et al., Cell Rep. 2014 6:357-65; Polikanov et al., Mol Cell. 2014 56:541-50; Svidritskiy E, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 110:12283-8). Имеющиеся публикации нашей группы (Polikanov YS*, Osterman IA* et al., Mol Cell. 2014 56:531-40.* авторы, внесшие равный вклад в работу; Osterman IA. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2016) и группы профессора Вилсона (Arenz S, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2016 113:7527-32; Seefeldt AC, et al., Nucleic Acids Res. 2016 44:2429-38; Polikanov YS, et al., Mol Cell. 2015 58:832-44; Seefeldt AC, et al., Nat Struct Mol Biol. 2015 22:470-5) также свидетельствуют о высоком интересе международного научного сообщества к данной теме, ее уровне и актуальности.
Работа по выполнению проекта будет осуществляться группой И. Остермана в Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова в сотрудничестве с группой профессора Д. Вилсона из Университета Гамбурга, Германия. Кроме того, имеется договоренность о сотрудничестве обеих участвующих групп при выполнении данной работы с группой Ю. Поликанова, Университет Иллинойса, Чикаго (без финансовой поддержки фондами РНФ и DFG). Все участники проекта имеют существенный задел и успешный опыт работы по исследованию антибиотиков, действующих на рибосому. Группой И. Остермана разработаны сенсорные репортерные штаммы для выявления ингибиторов трансляции. Первый вариант такого репортерного штамма был создан в 2012 году (Osterman I.A., et al., 2012. Antimicrob Agents Chemother. 56:1774-83). В 2016 году, при выполнении договора о предоставлении субсидии Минобрнауки был создан усовершенствованный вариант репортерного штамма с улучшенными характеристиками (Osterman I.A., et al., 2016. Antimicrob Agents Chemother. В печати) и найдены два семейства лидерных молекул – ингибиторов биосинтеза белка. С помощью созданных репертерных штаммов было определено, что малоизученный антибиотик амикумацин А ингибирует трансляцию, а затем его механизм действия был подробно изучен структурными и биохимическими методами. Эта работа положила начало успешному сотрудничеству группы И. Остермана и Ю. Поликанова (Университет Иллинойса), приведшая к публикации в журнале Molecular Cell
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 28 февраля 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Поиск и изучение новых антибиотиков, подавляющих работу рибосомы |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в 2018 году при помощи репортеной системы pDualrep2 был проведен широкомасштабный анализ разнообразных образцов, потенциально обладающий антибактериальной активностью. Система pDualrep2 позволяет одновременно определять эффективность действия (по размеру зоны ингибирования), а также определять механизм действия по индукции сигнала флуоресцентного белка (индукция Katushka2S – ингибирование синтеза белка, индукция Turbo-RFP – активация системы SOS-ответа). Все имеющиеся образцы наносили на чашки Петри с репортерным штаммом E.coli dtolC:pDualrep2 (dtolC повышает поднять чувствительность), проводили Отбор отбор тех, что вызывают индукцию белка Katushla2S. Чуть менее тысячи образцов (960) было получено для анализа из лаборатории профессора Суна (http://www.imb.com.cn/en/educateCon.aspx?faid=65&rid=714), с которым в 2018 началось плотное сотрудничество для поиска новых антибиотиков, благодаря к доступу уникальных образцов обнаруженных на территории Китая, есть шанс обнаружить новые антибиотики. Предоставленные образцы представляли собой неочищенные образцы культуральных жидкостей, в который культивировали различные бактерии. 1152 образца было предоставлено для анализа из лаборатории О.В. Ефременковой, ФГБУН Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе. Эти образцы также были получены из природных источников. 384 образца было получено от Д.В. Аксенова-Грибанов ФГБОУ ВПО ИГУ, природные образцы, полученные от бактерий и других организмов озера Байкал, что обуславливает их актиуальность. 192 образца от А. Берестецкого, ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ, образцы растительных и грибных экстрактов. 960 образцов от Афиятуллов Ш.Ш., ТИБОХ ДВО РАН, образцы полученные от бактерий и грибов Дальнего Востока и Тихого океана. 480 образцов от А. Тевяшевой, ФГБУН Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе. Синтетические образцы, полученные при синтезе новых антибиотиков на основе конъюгатов. 480 образцов от Э. Ямансарова, Уфимский Институт химии, различные новые синтезированные молекулы, потенциально обладающие антибактериальной активностью. 480 образцов от Н. Ворожцова, Химический факультет МГУ, различные новые синтезированные молекулы, потенциально обладающие антибактериальной активностью. Таким образом за год проанализировано не менее 5088 образцов (в дополнение к большим наборам образцов велся регулярный анализ десятков образцов, получаемых от коллабораторов). Для работы с 2-гуанидино-ханазолином и пиридинил-пиперидин карбоксамидом коллегами синтетиками был проведен ресинтез этих образов (ранее они были обнаружены в ходе анализа коммерчески доступной библиотеки). К сожалению, образец пиридинил-пиперидин карбоксамида оказался неактивным, а тестируемый ранее образец, как оказалось, представлял собой смесь веществ, получившихся, скорее всего, в результате деградации. Определить какой из продуктов деградации обладал активность пока не удалось – эта работа будет продолжена. Для 2-гуанидин-ханазолинов был проведен сравнительный анализ большого набора образцов, обладающих активность подавлять синтез белка, и среди них выбраны два наиболее эффективных (см. дополнительные материалы). На их основе был получен гибрид, для которого был проведен анализ способности ингибировать синтез белка. Затем был проведен анализ механизма воздействия гибридного образца на продвижение рибосомы по мРНК при помощи тоепринтинга. В настоящий момент образец передан на структурный анализ партеру данного проекта профессору Вилсону для проведения структурных исследований. В ходе изучения культуральных жидкостей почвенных бактерий был обнаружен штамм бактерии Amycolatopsis, которая продуцировала вещество, нарушающее синтез белка. При помощи обращено-фазовой хроматографии был выделен активный компонент, после получения ЯМР и масс-спектрометрических данных удалось установить, что это тетрациномицин Х (доп материалы). Ранее для этого антибиотика предполагали, что он интеркалирует в ДНК, однако, данные репоортерной системы pDualrep2 и эксперименты по синтезу белка в бесклетоно системе показали, что это ингибитор синтеза белка. В дальнейшем будут изучены детали механизма действия, а также планируется получить данные о структуре взаимодействия этого антибиотика с рибосомой при помощи криоЭМ в сотрудничестве в профессором Вилсоном. От профессора Вилсона получены два антибиотика, ингибитора синтеза белка, для детального изучения механизма действия. Первый – терморубин, второй – аргирин. Для терморубина планируется обнаружить мутации в рРНК, дающие устойчивость, чтобы подтвердить сайт связывания с рибосомой в E. Coli (в литературе есть данные только Thermus thermophilus). Для аргирина предполагаемая мишень – элонгационный фактор G, так как есть литературные данные по мутациям устойчивости), в ходе работы планируется получить мутантные формы EF-G, чтобы проверить в бесклеточной системе механизм действия этого антибиотика. Ранее нами был определено, что для клебсазолцина (нового тиазол-оксазол-модифицированого пептида) мишенью действия являются рибосома. В ходе 2018 года было доказано, что клебсазолицин, полученный при проведении реакций модификации пептида в пробирке тоже обладает активность подавлять синтез белка. Детально изучен механизм действия диритромицина, макролидного произвожного эритромицина. Показано, что диритромицин лучше связывается с рибосомой и эффективнее подавляет синтез белка в бесклеточной системе. При помощи рентген-структурного анализа (в сотрудничестве с профессором Ю. Поликановым) установлена структура диритромицина с рибосомой и визуализован дополнительный контакт между антибиотиков и рибосомой, которого нет в комплексе эритромицина и рибосомы. Коллектив профессора Уилсона в 2018 закончил исследования комплекса апидацина с рибосомой и факторами терминации. Полученные в ходе работы отражены четырех опубликованных работах. Результаты представлены на конференции FEBS 7-12 июля 2018 Прага, Чехия (тезисы доклада опубликованы в журнале Open Bio), а также на специализированной конференции Ribosome and translation 13-16 мая Санкт-Петербург, Россия. | ||
2 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Поиск и изучение новых антибиотиков, подавляющих работу рибосомы |
Результаты этапа: 1) В ходе высокопроизводительного скрининга более двух тысяч образцов обнаружены новые образцы, содержащие ингибиторы синтеза белка. Анализ уникальных образцов, предоставленных нашими коллегами из Китая, выявил 5 штаммов, продуцирующих ингибиторs синтеза белка. Результаты опубликованы в журнале Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, входящем в Q1. Показано, что алдгамицины, малоизученные макролидные антибиотики, индуцируют репортер на ингибиторы синтеза белка, а также подавляют рост штаммов, с устойчивость к макролидам. Обнаружен новый ингибитор синтеза белка, продуцируемый штаммом Actinoplanes sp. 49252, исходя из мутаций устойчивости (таких мутаций ранее детектировано не было), это новая молекула с антибактериальной активностью. Показано, что молекула имеющая фрагменто хлорамфеникола и трифенилфосфония (SkQ) обладает антибактериальной активностью и ее механизм действия отличается оттхлорамфеникола. 2) На генетическом, биохимическом и структурном уровне изучен механизм нового тиазол-оксазол-модифицированного микроцина – фазолицина. Изучена структура комплекса данного антибиотика с рибосомой E.coli, методом КриоЭМ, биохимически показано, что фазолицин препятствует выходу синтезируемого пептида из рибосомы. Результаты опубликованы в журнале Nature Communications (Q1, IF-11). 3) Изучен механизм действия макролида диритромицина на молекулярном уровне, получено объяснение разной активности диритромицина и эритромицина. Структурные исследования проводились на рибосомах Thermus thermophilus, результаты опубликованы в журнале Antimicrobial agents and chemotherapy (Q1). 4) На генетическом, биохимическом и структурном уровне изучен механизм нового ингибитора синтеза белка – тетрациномицина Х, подготовлена статья для отправки в журнал Nature Chemical Biology. 5) Показано, что аналог хлорамфеникола (конъюгат с трифенилфосфонием) подавляет синтез белка, при этом действует на рибосомы отличным от хлорамфеникола образом. 6) Получены новые данные, характеризующие механизм действия 2-гуанидин-хиназолинов, аргирина и терморубина. Для 2-гуанидин-хиназолинов найден наиболее активный образец, показано положение заблокированной рибосомы на мРНК после действия антибиотика, проверено, что он не вызывает диссоциацию рибосомных субчастиц. Для терморубина обнаружены мутации устойчивости в гену yobF и в регуляторной области белка S10, эти результаты помогут в дальнейшем уточнить механизм действия этого антибиотика. | ||
3 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Поиск и изучение новых антибиотиков, подавляющих работу рибосомы |
Результаты этапа: Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном году 1) Детально изучен механизм действия антибиотика тетраценомицина Х, получены микробиологические, биохимические и структурные (совместно с немецким партнером данного проекта) данные о действии данного антибиотика. Результаты опубликованы в журнале Nature Chemical Biology (Q1, IF 12.6). 2) Изучен механизм действия антибиотика диритромицина на рибосомы E.coli, проведено детальное сравнение данного антибиотика с эритромицином, впервые получена структура рибосомы E.coli при помощи криоэлектронной микроскопии в России. Результаты опубликованы в журнале RNA (Q1 IF 3.7). 3) Обнаружены новые потенциальные ингибиторы синтеза белка, проанализирована большой набор природных и синтетических молекул. Часть результатов опубликованы в журнале Journal of Asian Natural Products Research (Q2, IF 1.2) 4) Определена структура нового ингибитора синтеза белка, продуцируемого штаммом Actinoplanes sp. 49252 – обнаружена не описанная ранее природная молекула. Получены первые данные по характеру взаимодействия с рибосомой (совместно с немецкий партнером). Обнаружены мутации в рРНК (16S С564G, A555del), дающие устойчивость к действию данного антибиотика – данные мутации ранее обнаружены не были, что повышает вероятность обнаружения нового сайта связывания для данной молекулы. 5) Завершена работа по изучения механизма действия конъюгатов хлорамфеникола с трифенилфосфонием, обнаружен сайт связывания данного антибиотика на рибосоме, показано отличие от хлорамфеникола в механизме действия. Результаты готовятся к публикации. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".