ИСТИНА

В ходе НИР был проведен анализ образцов спермы пациентов с астенозооспермией, связанной с дисплазией фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов, включающий микроскопические и электронно-микроскопические исследования, а также определение содержания, активности и внутриклеточного распределения спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDS) с целью выявления возможной связи этого заболевания с недостаточностью или изменением свойств GAPDS. Было запланировано получение новых клонов E.сoli, несущих гены, кодирующие неполноразмерную последовательность GAPDS человека с полностью или частично удаленным N-концевым доменом с целью получения рекомбинантных форм, обладающих каталитической активностью и максимально близкой к нативному ферменту пространственной структурой. Планировалось дальнейшее изучение полученных ранее клонов E.сoli, кодирующих полноразмерную последовательность GAPDS человека и последовательность GAPDS, в которой N-концевой домен заменен на хитин-связывающий домен (ChBD) с целью увеличения выхода активного целевого продукта за счет изменения условий культивирования. Было запланировано выделение необходимых для кристаллографических исследований количеств рекомбинантной GAPDS человека из клеток E.Coli с помощью традиционных методов очистки, а также аффинной хроматографии на хитин-содержащих сорбентах. Планировалось получение поликлональных антител на рекомбинантную GAPDS, необходимых для определения содержания GAPDS в различных образцах сперматозоидов и для изучения внтуриклеточной локализации фермента. Использование высокоочищенных препаратов GAPDS для скрининга условий кристаллизации с рентгенодифракционном тест контролем совершенства кристаллов, что является необходимым условием предваряющим собственно выращивание высокосовершенных монокристаллов, пригодных получения от них рентгенодифракционного фурье-спектра уже с использованием синхротронного излучения.

Исследованы морфологические, ультраструктурные и биохимические особенности спермы пациентов с с астенозооспермией, связанной с дисплазией фиброзного слоя жгутиков. Выявлена связь данного наследственного заболевания с недостаточностью белка GAPDS; Получен новый клон E.сoli, продуцирующий GAPDS человека без N-концевого домена (dN-GAPDS). Из указанного клона выделен активный рекомбинантный белок dN-GAPDS и исследованы его свойства. Продолжаются исследования клона E.coli продуцирующего полноразмерный белок GAPDS с целью подбора условий для его эффективной экстракции и выделения в активной форме. Для проведения кристаллографических исследований выделен рекомбинантный белок dN-GAPDS, близкий по структуре к полноразмерной человеческой GAPDS. С целью получения поликлональных антител к GAPDS человека проведена иммунизация кролика рекомбинантным белком dN-GAPDS. Получена сыворотка с антителами против dN-GAPDS. Проведен скрининг условий кристаллизации рекомбинантной человеческой GAPDS с хитинсвязывающим доменом (ChBD-GAPDS). В ходе первоначального скрининга условий наилучшие результаты были достигнуты при pH 6,5-7,2 в присутствии 30% полиэтиленгликоля (PEG-3350).