|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Направленная интеграция пенного вируса человека с использованием химерных белков на основе интегразы и домена "цинковых пальцев"НИР
- Руководитель НИР: Готтих М.Б.
- Участники НИР: Княжанская Е.С., Кондрашина О.В.
- Подразделение: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского
- Срок исполнения: 1 января 2009 г. - 31 декабря 2011 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 09-04-93110-НЦНИЛ_а
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Геномика, протеомика. Белковая и генная инженерия. Трансгеноз, генотерапия. Молекулярная медицина.
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.17 Макромолекулярные ассоциации и проблемы узнавания в молекулярной биологии
-
Ключевые слова:
сиквенс-специфичное узнавание днк, направленная интеграция, интеграза, пенный вирус человека, клеточный партнер интегразы, химерный белок
-
Описание:
Благодаря своей способности интегрироваться в геном неделящихся клеток, ретровирусы активно используются как база для создания генно-терапевтических векторов. Однако возможность возникновения онкологических заболеваний у пациентов, которые подвергаются генной терапии с использованием ретровирусных векторов, ограничивает применение ретровирусной терапии и делает крайне актуальной разработку векторов для направленной интеграции ДНК. Стратегия направленной интеграции предполагает создание химерных белков, содержащих домен, способный сиквенс-специфично связывать ДНК, и ретровирусной интегразы - фермента, непосредственно осуществляющего интеграцию вирусного генома в клеточный. В случае интегразы ВИЧ-1, такие гибриды показали способность к направленной интеграции вблизи своих сайтов узнавания в ДНК-мишени. Конкретной задачей настоящего проекта является создание конструкций для направленной интеграции ДНК на основе двух интеграз: ВИЧ-1 и пенообразующего вируса человека (Human foamy virus - HFV). Этот вирус относится к подгруппе Spumaviridae семейства ретровирусов. В качестве сайта интеграции выбрана уникальная для генома человека 18-ти звенная последовательность в гене лейциновой тРНК. Впервые сконструирован белок, содержащий структурные мотивы «цинковые пальцы», специфически узнающие каждый из шести нуклеотидных триплетов в этой последовательности (белок tRL18). Показано, что белок tRL18 связывает свою мишень более специфично, чем ДНК случайной последовательности. Получены конструкты, кодирующие гибридные белки, несущие ген нового белка либо на N-, либо на С-конце интеграз ВИЧ-1 и HFV, и выделены соответствующие белки. Проведен подбор и оптимизация условий интеграции гибридными белками на основе белка tRL18 и интеграз ВИЧ-1 и HFV, в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. Показано, что интеграция более эффективно протекает в случае гибридов на основе интегразы HFV. В присутствии ионов Mg2+, который является природным кофактором ретровирусных интеграз, около 75% от общего продукта интеграции составлял продукт согласованной интеграции, который соответствует продукту встраивания обоих концов вирусной ДНК в клеточную. Исследована направленность интеграции гибридными белками в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. Показано, что наибольшую направленность интеграции обеспечивает С-концевой гибрид интегразы HFV в буфере, содержащем ионы магния. Так, значительно снизилась интенсивность интеграции вокруг сайта узнавания белка tRL18, поскольку белок связывается с ним и препятствует интеграции в него, также частота интеграции гибридом возрастает в участках, непосредственно прилегающих к сайту. Основные точки располагаются в позициях 6, 20, 46 и 52 выше по цепи от сайта, и в позициях 4, 12, 18 и 46 ниже по цепи.
-
Основные результаты:
Впервые сконструирован белок, содержащий структурные мотивы «цинковые пальцы», специфически узнающие каждый из шести нуклеотидных триплетов в этой последовательности (белок tRL18). Показано, что белок tRL18 связывает свою мишень более специфично, чем ДНК случайной последовательности. Получены конструкты, кодирующие гибридные белки, несущие ген нового белка либо на N-, либо на С-конце интеграз ВИЧ-1 и HFV, и выделены соответствующие белки. Проведен подбор и оптимизация условий интеграции гибридными белками на основе белка tRL18 и интеграз ВИЧ-1 и HFV, в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. Показано, что интеграция более эффективно протекает в случае гибридов на основе интегразы HFV. В присутствии ионов Mg2+, который является природным кофактором ретровирусных интеграз, около 75% от общего продукта интеграции составлял продукт согласованной интеграции, который соответствует продукту встраивания обоих концов вирусной ДНК в клеточную. Исследована направленность интеграции гибридными белками в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. Показано, что наибольшую направленность интеграции обеспечивает С-концевой гибрид интегразы HFV в буфере, содержащем ионы магния. Так, значительно снизилась интенсивность интеграции вокруг сайта узнавания белка tRL18, поскольку белок связывается с ним и препятствует интеграции в него, также частота интеграции гибридом возрастает в участках, непосредственно прилегающих к сайту. Основные точки располагаются в позициях 6, 20, 46 и 52 выше по цепи от сайта, и в позициях 4, 12, 18 и 46 ниже по цепи.
- Добавил в систему: Готтих Марина Борисовна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2009 г.-31 декабря 2009 г. | Конструирование векторов прокариотической экспрессии для получения химерных белков интеграза-цинковый палец и цинковый палец-интеграза |
| Результаты этапа: Конкретной задачей настоящего проекта является создание конструкций для направленной интеграции ДНК на основе пенного вируса человека (Human foamy virus - HFV). Этот вирус относится к подгруппе Spumaviridae семейства ретровирусов. Он не является патогенным для человека, но вместе с тем он способен эффективно заражать различные типы клеток. За отчетный период подробно охарактеризована ДНК-связывающая и каталитическая активность интегразы HFV. В качестве сайта интеграции выбрана уникальная для генома человека 18-ти звенная последовательность в гене лейциновой тРНК. Впервые сконструирован белок, содержащих структурный мотив «цинковый палец», специфически узнающий каждый из шести нуклеотидных триплетов в этой последовательности, синтезирован его ген и начата работа по получению векторов для экспрессии интегразы HFV и интегразы ВИЧ-1, слитой с этим ДНК-узнающим белком. | ||
| 2 | 1 января 2010 г.-31 декабря 2010 г. | Получение и характеристика синтетического белка, содержащего мотив "цинковые пальцы" (ЦП) для специфического узнавания выбранной последовательности-мишени, а также гибридов этого белка и интегразы HFV и ВИЧ-1 |
| Результаты этапа: За отчетный период был выделен белок tRL18 и было показано, что он связывает свою мишень более специфично, чем ДНК случайной последовательности. Также были получены конструкты, кодирующие гибридные белки, несущие ген нового белка либо на N-, либо на С-конце интеграз ВИЧ-1 и HFV. Выделенные с использованием этих конструктов гибридные белки были охарактеризованы в реакциях переноса цепи, а так же определено их сродство к различным последовательностям ДНК. Гибрид, несущий белок tRL18 на С-конце интегразы HFV, оказался практически неактивным в реакции переноса цепи. Наконец, была проверена способность гибридных белков интегрировать короткий ДНК-субстрат в плазмидный вектор и в линейные фрагменты ДНК, а также проведены эксперименты по определению направленности интеграции, осуществляемой гибридными белками. | ||
| 3 | 1 января 2011 г.-31 декабря 2011 г. | Оптимизация условий интеграции гибридными белками на основе белка tRL18 и интеграз ВИЧ-1 и HFV (Human foamy virus), в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. |
| Результаты этапа: Впервые сконструирован белок, содержащий структурные мотивы «цинковые пальцы», специфически узнающие каждый из шести нуклеотидных триплетов в этой последовательности (белок tRL18). Показано, что белок tRL18 связывает свою мишень более специфично, чем ДНК случайной последовательности. Получены конструкты, кодирующие гибридные белки, несущие ген нового белка либо на N-, либо на С-конце интеграз ВИЧ-1 и HFV, и выделены соответствующие белки. Проведен подбор и оптимизация условий интеграции гибридными белками на основе белка tRL18 и интеграз ВИЧ-1 и HFV, в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. Показано, что интеграция более эффективно протекает в случае гибридов на основе интегразы HFV. В присутствии ионов Mg2+, который является природным кофактором ретровирусных интеграз, около 75% от общего продукта интеграции составлял продукт согласованной интеграции, который соответствует продукту встраивания обоих концов вирусной ДНК в клеточную. Исследована направленность интеграции гибридными белками в плазмидную конструкцию, содержащую сайт узнавания белка tRL18. Показано, что наибольшую направленность интеграции обеспечивает С-концевой гибрид интегразы HFV в буфере, содержащем ионы магния. Так, значительно снизилась интенсивность интеграции вокруг сайта узнавания белка tRL18, поскольку белок связывается с ним и препятствует интеграции в него, также частота интеграции гибридом возрастает в участках, непосредственно прилегающих к сайту. Основные точки располагаются в позициях 6, 20, 46 и 52 выше по цепи от сайта, и в позициях 4, 12, 18 и 46 ниже по цепи. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".