Функционирование диазотрофно-целлюлолитического комплекса микроорганизмов кишечника птиц-фитофагов (на примере сем. Тетеревиные)НИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 апреля 2012 г.-31 декабря 2012 г. Этап 2012 года
Результаты этапа: В 2012 году был осуществлен первый этап комплексного изучения микробного комплекса желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) тетеревиных птиц для оценки его вклада в пищеварение. У двух видов тетеревиных птиц, тетерева-косача (Lyrurus tetrix) и глухаря обыкновенного (Tetrao urogallus) были измерены основные интегральные показатели микробного сообщества следующих отделов желудочно-кишечного тракта: зоба, желудка, тонкого кишечника и слепой кишки. Общая численность микроорганизмов в ЖКТ птиц была максимальной в толстом отделе кишечника (10,2 и 10,5 lgKOE/г у тетерева и глухаря, соответственно). В результате мультисубстратного тестирования сообществ было установлено, что микробоценозы глухаря и тетерева имеют ряд принципиальных сходств. У обеих птиц индекс разнообразия Шеннона, общая метаболическая активность и число потребляемых субстратов были максимальны для сообщества слепой кишки и минимальны для зоба и желудка (H=4.6; H=3,5; Н=3,8; W=1750; W=920; W=1010; N=28, N=12, N=21 и H=4.7; H=3,8; Н=4,2; W=1600; W=1050; W=1200; N=28, N=15, N=19 для глухаря и тетерева соответственно). При этом сообщество тонкого кишечника лишь немного отличалось от сообщества слепой кишки. Микробоценозы слепой и тонкой кишок активно метаболизировали полисахариды и жирные кислоты (продукты их гидролиза). Сообщества желудка и зоба потребляли, в основном, короткоцепоцечные сахара и аминокислоты. Нитрогеназная активность в ЖКТ птиц, добытых в разные сезоны, достоверно различалась (Mann-Whitney U Test, Z=2,75, p=0,00597) и была выше в весенний период, когда птицы питаются бедным растительным кормом. Максимальные значения азотфиксации были зафиксированы в толстом отделе кишечника и достигали 812 нг N2/ г*ч у глухаря и 159,48 нг N2/ г*ч у тетерева. Целлобиогидролазная активность в слепой кишке тетерева и глухаря достоверно не различалась (Mann-Whitney U Test, p=0,077), однако в целом была выше у глухаря. Для таксономической характеристики микробного сообщества ЖКТ тетеревиных птиц были спроектированы универсальные праймеры для PCR-DGGE анализа: (F1/R1, F2/R2, F3/R3, NF1/NR1, NF2/NR2, CF1/CR1). Разделенные ампликоны были секвенированы, чтобы получить возможность определить общий видовой состав микробиоты, а также состав азотфиксаторов и целюллолитиков по отдельности.
2 1 апреля 2013 г.-31 декабря 2013 г. Этап 2013 года
Результаты этапа: За отчетные период были проведены следующие работы: Отстрел особей обыкновенного глухаря и тетерева косача отдельно в весенний, отдельно в летний период. Отбор образцов содержимого их желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Измерение целлобиогидролазной и нитрогеназной активностей в содержимого ЖКТ. Изучение интегральных функциональных возможностей микробного сообщества слепой кишки тетеревиных птиц. Результаты измерений микробиологической активности затем соотносились с характером корма из зоба и желудка. Изучение качественного состава сообщества слепой кишки тетеревиных птиц методом PCR-DGGE. Изучение и выделение микроорганизмов сообщества слепой кишки тетеревиных птиц, способных к активной азотфиксации и деградации целлюлозы. Были получены следующие данные: целлобиогидролазная активность в слепой кишке обеих птиц достоверно отличались в разные сезоны. Весной, когда птицы питаются низкобелковыми трудноперевариваемыми кормами активность разложения целлюлозы была более чем в 3 раз выше, чем летом при питании более питательными кормами. Несмотря на то, что содержание азота весной в кормах тетеревиных птиц было в полтора раза ниже, чем летом, активность азотфиксации сезонной динамики не имела. Общая метаболическая активность сообществ слепой кишки тетеревиных в оба сезона оставалась одинаковой. Однако весной спектр потребляемых субстратов был существенно ниже: 31 субстрат против 22. При этом весной список усваиваемых субстратов состоял преимущественно из жирных кислот – продуктов брожения целлюлозы. Эти данные позволяют предполагать, что кишечное сообщество слепой кишки интенсивно приспосабливается к кормовой базе. В зимне-весенний период роль диазотрофно-целлюлолитического комплекса значительно возрастает. С помощью метода PCR-DGGE был получен следующий таксономический список сообщества слепой кишки тетерева (весенний период): Acinetobacter lwoffii, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridium sp., Enterobacter cloacae, Enterococcus mundtii, Escherichia coli, Eubacterium sp., Kocuria rosea, Lactobacillus sp., Pantoea agglomerans, Rahnella aquatis, а также пять некультивируемых форм. При этом на безазотистой среде были успешно выделены культуры: Acinetobacter lwoffii, Pantoea agglomerans, Enterobacter cloacae, Rahnella aquatis, а также представители группы cytophaga-flavobacteria (который не был выявлен методом PCR-DGGE). Полученные данные говорят о том, что треть доминантов сообщества слепой кишки тетерева способна к активной азотфиксации.
3 1 апреля 2014 г.-31 декабря 2014 г. Этап 2014 года
Результаты этапа: В настоящей работе были изучены основные параметры функционирования диазотрофно-целлюлолитического микробного комплекса ЖКТ у диких тетеревиных птиц. Данные птицы существуют при контрастной диете, включающей очень бедный зимний рацион и более богатый летний рацион. Поэтому мы проводили исследования ранней весной (птицы еще на зимнем рационе) и ранней осенью (птицы еще на летнем рационе). Одним из возможных источником экстра-азота может служить микробная азотфиксация в ЖКТ. Вне зависимости от сезона максимальные значения азотфиксации были обнаружены в слепой кишке птиц (до 0,81 ± 0,13 нмоль С2Н4/г*ч). Наименьших уровней НА достигала в тонком кишечнике. По абсолютным значениям азотфиксация в толстом кишечнике тетеревиных птиц приближается к значениям у грызунов и зайцеобразных. Другим возможным источником дополнительного азота в слепой кишке может служить рециклизация мочевой кислоты. У тетерева-косача уреазная активность была обнаружена во всех отделах ЖКТ тетерева кроме зоба. Максимальных значений она достигала в слепой кишке (41,3 мг N-NH3/г?ч). Эти значения сопоставимы с величинами у жвачных животных, для которых роль рециклизации азота хорошо известна. Кроме того, была обнаружена сезонная динамика уреазной активности, что говорит о связи этого процесса с пищевым рационом. Другим важнейшим вкладом микробного сообщества ЖКТ в пищеварение является деградация трудноусвояемых полимеров. Нами показано, что максимальные значения и эндоглюконазной (ЭА), и целлобиогидролазной активностей (ЦА) были зафиксированы в слепой кишке как у тетерева, так и у глухаря (ЭА - 573, 2 мкмоль/г*мин и 480,0 мкмоль/г*мин; ЦА - 0,98 и 1,33 мкмоль/г*мин, соответственно). Полученные значения соответствуют значениям, наблюдаемым у типичных животных-ксилофагов: зайцеобразных и жвачных. Помимо указанных процессов нами была изучена общая метаболическая активность микробиома тетеревиных методом мультисубстратного тестирования (МСТ). Число потребляемых субстратов и индекс биоразнообразия Шеннона летом для сообщества слепой кишки были выше, чем весной: H=4,8 против Н=4,2; N=31 против N= 22; и в зобе: H=3,5 против Н=3,2; N=18 против N=13. Однако весной было выше разнообразие потребляемых жирных кислот – продуктов брожения структурных углеводов. Показатели биоразнообразия в других отделах кишечника (желудке и тонком кишечнике) весной и летом не отличались. Также было изучено видовое разнообразие как целого микробиома ЖКТ тетерева, так и его диазотрофно-целлюлолитического звена. В результате ПЦР-ДГГЭ анализа участков 16S-рРНК было установлено, что основными доминантами весеннего комплекса являются: Acinetobacter lwoffii, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridium sp., Enterobacter cloacae, Enterococcus mundtii, Escherichia coli, Eubacterium sp., Kocuria rosea, Lactobacillus sp., Pantoea agglomerans, Rahnella aquatis, а также ряд некультивируемых видов. Осенью разнообразие этого комплекса заметно снижается и ограничивается типично кишечными видами. В результате ПЦР-ДГГЭ анализа участков nifH-генов (азотфиксаторов) были получен следующий список: Bacillus pumilus/licheniformis, Clostridium butyricum/beijerinckii, Enterobacter cloacae. Полученные данные свидетельствует о высокой значимости микробиома слепой кишки в пищеварении тетеревиных. Он участвует как в гидролизе неперевариваемых полимеров, так и частично компенсирует дефицит диетарного азота.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".