ИСТИНА

Выделить терминальные оксидазы bd-типа из Geobacillus thermodenitrificans (старое название - Bacillus stearothermophilus) и Escherichia coli. С помощью метода абсорбционной спектроскопии исследовать спектральные свойства цитохрома bd из G. thermodenitrificans в разных состояниях окисления и лигандирования. Особое внимание уделить изучению спектральных характеристик «окисленного на воздухе» фермента, его полностью восстановленной формы, а также комплекса полностью восстановленной оксидазы с монооксидом углерода (СО). С помощью метода магнитного кругового дихроизма изучить сигналы МКД цитохрома bd из G. thermodenitrificans в разных состояниях окисления и лигандирования. Исследовать спектры МКД «окисленного на воздухе» фермента, его полностью восстановленной формы, а также комплекса полностью восстановленной оксидазы с СО. Выяснить природу гемовых центров фермента, определить их спиновое и редокс-состояние. Ответить на вопрос, есть ли в ферменте гем b595 и в каком количестве; исследовать свойства гемовых комплексов с СО; понять, в какой степени каждый из гемов связывает этот внешний лиганд. Провести анализ природы аксиальных лигандов низкоспинового гексакоординированного гема b558. С помощью метода естественного кругового дихроизма изучить сигналы КД цитохрома bd из G. thermodenitrificans в разных состояниях окисления и лигандирования. Исследовать спектры КД «окисленного на воздухе» фермента, его полностью восстановленной формы, а также комплекса полностью восстановленной оксидазы с СО.

Выделены и очищены терминальные оксидазы типа bd из Geobacillus thermodenitrificans и Escherichia coli. Используя методы абсорбционной спектроскопии, естественного кругового дихроизма (КД) и магнитного кругового дихроизма (МКД), сравнили свойства цитохромов bd из этих бактерий, принадлежащих двум разным подсемействам оксидаз типа bd, S и L, соответственно. Фермент из G. thermodenitrificans действительно содержит высокоспиновый пентакоординированный гем b595, несмотря на то, что характерная для него Q(00)-полоса при 595 нм («альфа»-полоса) не обнаруживается в спектрах поглощения. Стехиометрия гемов b558, b595 и d на молекулу фермента составляет 1:1:1. 20-25% восстановленного гема b595 в оксидазе из G. thermodenitrificans связывает CO, тогда как в случае фермента из E. coli в тех же экспериментальных условиях такая реакция является незначительной. В оксидазе из G. thermodenitrificans наблюдается пониженное экситонное взаимодействие между восстановленными высокоспиновыми гемами b595 и d в сравнении с таковым в ферменте из E. coli. Последнее может означать, что эти два фермента отличаются расстоянием между гемом d и гемом b595 и/или величиной угла между плоскостями их порфириновых колец. Полученные данные также свидетельствуют о том, что у цитохрома bd из G. thermodenitrificans шестым аксиальным лигандом гема b558 является остаток гистидина, а не метионина, как у фермента из E. coli.