| Результаты этапа: Методом измерения трансэндотелиального электрического сопротивления исследован и охарактеризован количественно доз-зависимый эффект аденозина (1-100 ?М) как агента, усиливающего барьерные свойства эндотелиального монослоя в норме и защищающего эндотелиальный барьер при действии веществ, вызывающих барьерную дисфункцию (тромбин и нокодазол). Методом прижизненного наблюдения количественно охарактеризован защитный эффект аденозина на поведение ламеллы эндотелиоцитов in vitro. Методом иммунофлуоресцентного анализа изучено действие аденозина на организацию VE-кадгериновых контактов и систему микротрубочек. Вызванное аденозином усиление эндотелиального барьера сопровождается повышением количества VE-кадгерина на поверхности клеток и реорганизацией системы микротрубочек эндотелиоцитов – во внутренней цитоплазме повышается количество как стабильных, так и динамичных микротрубочек, а на периферии клетки растет количество концов динамичных микротрубочек. Методом количественной оценки содержания белков в примембранном слое эндотелиоцитов проанализированы изменения количества актина, а также ацетилированного и тирозилированного тубулина (составляющих в эндотелиоцитах стабильные и динамичные микротрубочки соответственно) в районе VE-кадгериновых контактов в клетках, обработанных аденозином. В примембранном слое эндотелиоцитов по мере воздействия аденозина помимо постепенного увеличения количества актина наблюдается увеличение количества тирозилированного тубулина, тогда как количество ацетилированного тубулина не меняется. Резкое повышение количества тирозилированного тубулина происходит в первые 5 мин воздейстия аденозина и не меняется в течение последующих 60 мин воздействия. Таким образом, в результате воздействия аденозина резко возрастает количество плюс- концов именно динамичных (но не стабильных) микротрубочек в районе VE-кадгериновых контактов эндотелиоцитов. Полученные результаты подтверждают гипотезу, проверяемую в рамках выполнения настоящего проекта - концы
динамичных микротрубочек являются инструментом регуляции эндотелиальной проницаемости и в ситуации, противоположной развитию барьерной дисфункции – в процессе укрепления эндотелиального барьера. Исследованы различия в динамических характеристиках микротрубочек, полимеризующихся в разных участках эндотелиальных клеток человека в норме и в ходе воздействия аденозина. На основе анализа цейтраферной записи поведения плюс-концов индивидуальных микротрубочек описана их динамика во внутренней цитоплазме и на периферии эндотелиоцитов, экспрессирующих EB3-GFP - белок, который связывается с плюс- концами микротрубочек. Предварительные результаты сравнительного анализа показывают, что во время воздействия аденозина скорость роста плюс-концов микротрубочек на периферии эндотелиоцитов выше, а эпизоды роста концов микротрубочек продолжительнее, чем в контрольных клетках. Таким образом, выдвинутая нами гипотеза о том, что аденозин изменяет динамические свойства микротрубочек, получила экспериментальное подтверждение. |
