Сверхдлинные митохондрии ксилотрофных грибов: структура и функцииНИР

Extra-long mitochondria of xylotrophic fungi: structure and functions

Соисполнители НИР

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Координатор

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 9 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. Сверхдлинные митохондрии ксилотрофных грибов: структура и функции
Результаты этапа: Мы выполнили все поставленные нами на первый год реализации Проекта задачи. Далее полученные результаты разбиты на 5 пунктов в соответствии с приведенными выше запланированными на 2018 год работами. 1. Первейшей задачей нашего исследования является подбор флюоресцентных митохондриальных проб, которые эффективно метят митохондрии ксилотрофных базидиомицетов (оптимально) и представителей других групп грибов. Может показаться, что тут мы пошли по пути «изобретения велосипеда» - во многих экспериментальных микологических публикаций уже описано мечение митохондрий. В обзоре Hickey et al., 2005 приведены наиболее используемые для грибов митохондриальные пробы (родамин 123, DASPMI, митотрекер зеленый, FM1-43 и FM4-64, DiOC6(3)). Однако для большинства перечисленных проб отмечают либо наличие неспецифического мечения, либо низкое качество мечения. Из нашего личного опыта – потенциал-независимыймитотрекер зеленый очень плохо работает со многими мицелиальными грибами. И что очень важно, во всех случаях работы с грибами рабочие концентрации митохондриальных проб намного превышают концентрации, используемые для животных клеток, и в этом заключается своеобразная «микологическая проблема». Мы протестировали четыре митохондриальные пробы: родамин 6Ж, родамин 123, НАО (нонилакридин оранжевый) и AM4-64 (аналог FM4-64). Концентрации и прочие условия опытов подбирали для молодого мицелия четырех видов грибов - двух ксилотрофных базидиомицетов Stereum hirsutum и Pleurotus ostreatus, и двух нексилотрофных базидиомицетов Coprinus comatus и Rhizoctonia solani. Результаты отображены в Таблице 1 в приложенном файле. А. Прежде всего, оказалось, что все четыре пробы в оптимальных концентрациях дают сходную по микроморфологии картину митохондриомов у тестируемых грибов, что подтверждает специфичность мечения. Только у C. comatus отличаются результаты мечения родамином 6Ж и НАО, однако тут дело в наличии у данного вида двух субпопуляций митохондрий с разной поляризацией (см. п. 3). Дополнительно специфичность мечения мы проверили колокализацией сигналов от родамина 6Ж и НАО (Рис. 1 из приложенного файла - здесь и далее файл «Таблицы_и_иллюстрации.pdf»). Б. Родамин 123 и AM4-64 мы не рекомендуем для использования в качестве оптимальных грибных проб. Родамин 123 (Рис. 2 из приложенного файла) дает относительно неплохой результат, однако мощный сигнал достигается при больших концентрациях, чем в случае родамина 6Ж (3 мкг/мл против 30-300 нг/мл). АМ4-64 (Рис. 3 из приложенного файла) метит не все грибные клетки, к тому же, он одновременно выявляет эндоцитозные и вакуолярные компартменты клетки, и достигает митохондрий только через некоторый промежуток времени (у ксилотрофов быстрее, чем у других грибов). Наиболее качественное мечение митохондрий обеспечивают родамин 6Ж и НАО. Больше того, поскольку родамин 6Ж является потенциал-зависимой пробой, а НАО - нет, их совместное использование в совокупности с разобщителем дыхания дает возможность качественно оценить степень поляризации митохондрий. Нам не известны из литературы примеры использования такой тест-системы для грибов. В. Родамин 6Ж считается устаревшим флюорофором для мечения митохондрий (в отличие от более современного родамина 123). Однако мы показали, что родамин 6Ж не просто обеспечивает качественное мечение митохондрий ксилотрофных и других базидиомицетов (при соблюдении определенных условий - низкие рабочие концентрации и время наблюдения за сигналом не более 15 мин), но и обходит «микологическую проблему». Данный флюорофор уже в концентрации 3 нг/мл обеспечивает сигнал от грибных митохондрий, в концентрациях 30 и 300 нг/мл дает устойчивый мощный сигнал. Мы предполагаем, что родамин 6Ж легче поглощается грибными клетками, нежели другие митохондриальные пробы, включая родамин 123. Увеличение концентрации родамина 6Ж усиливает митохондриальный сигнал, но и усиливает артефакты мечения. Малые рабочие концентрации, усиление сигнала при возрастании концентрации, а также наши результаты использования разобщителя BAM15 (см. п. 3) указывают на то, что в диапазоне приведенных концентраций родамин 6Ж работает в режиме без гашения. С особенностями режимов с гашением и без гашения можно ознакомиться в публикации Perry et al., 2011 и на Рис. 4 из приложенного файла. Мы, вероятно, первые, кто определил режим работы используемой для мечения грибных митохондрий пробы, что методически важно для исключения ошибок в оценке степени поляризации митохондрий. 2. Получив в свои руки эффективный инструмент для изучения грибных митохондрий в виде родамина 6Ж и НАО, мы детально исследовали микроморфологию сверхдлинных митохондрий ксилотрофных грибов, сравнили ее с микроморфологией митохондрий у нексилотрофов; оценили изменение митохондриомов в зависимости от типа питательной среды и от возраста мицелия; изучили вопрос межклеточности сверхдлинных митохондрий. А. Результаты анализа флюоресцентной микроморфологии митохондрий 6 видов грибов (4 ксилотрофных базидиомицета, 2 - нексилотрофных) отображены в Таблицах 1 и 2 в приложенном файле. Кратко результаты мечения митохондрий 300 нг/мл родамином 6Ж и 1 мкМ НАО 4-6 суточного мицелия (краевая зона колонии) на среде Чапека следующие: 1). Мы подтвердили наш предварительный результат, который явился причиной подачи данного Проекта на конкурс - сверхдлинные митохондрии существуют. Все 4 протестированных вида ксилотрофных базидиомицетов (Таблица 2 в приложенном файле) содержат во многих своих клетках очень длинные нитевидно-сосудовидные митохондрии, нередко разветвленные или даже формирующие сети (Рис. 5 в приложенном файле). Длина таких митохондрий достигает 100 мкм и более (ограничение - длина грибной клетки). Результат подтвержден и другими пробами (родамином 123 и АМ4-64 для S. hirsutum и P. ostreatus) (Рис. 2 и 3 в приложенном файле). Сверхдлинные митохондрии свойственны исключительно ксилотрофным грибам. Длинные митохондрии у ксилотрофных грибов обнаруживали и до нас (Weber et al., 1998), однако только современные флюоресцентные методы позволили нам выявить реальные впечатляющие размеры и подробно изучить цитологию и отчасти физиологию данных структур. 2). Фитопатогенный гетеробазидиомицет R. solani имеет в своих клетах густую митохондриальную сеть, состоящую из тонких нитевидных часто ветвящихся митохондрий. Содержание митохондрий на клетку у данного гриба выше, чем у других изученных грибов. Митохондрии R. solani четко отличаются от сверхдлинных митохондрий ксилотрофов - они тоньше, короче, их сеть гуще (Рис. 6 из приложенного файла). 3). Гумусовый сапротроф C. comatus несет преимущественно короткие палочковидные митохондрии, в меньшей степени зернистые или нитевидные длиной до 20 мкм. Однако такую картину дает либо использование НАО, либо высоких концентраций родамина 6Ж. Родамин 6Ж в концентрации до 300 нг/мл выявляет лишь палочковидные и зернистые митохондрии (Рис. 7 из приложенного файла). 4). Апикальные клетки гиф всех изученных грибов содержат большое количество зернистых митохондрий (хотя встречаются апексы и другого типа, с нитевидными митохондриями). Б. Флюоресцентный анализ митохондриомов 6 изучаемых видов грибов, культивируемых на трех разных питательных средах, отображен в Таблице 2 в приложенном файле. Мы использовали богатую среду мальт-агар, искусственную среду Чапека (полная по углероду и азоту, но не содержит добавки микроэлементов, и азот представлен в виде нитрата) и обедненную по азоту среду (среда Чапека без добавления нитрата). На последней среде продолжительно расти способны только ксилотрофы, остальные грибы дают слабый ограниченный рост. Основной результат сравнения митохондриомов на разных питательных средах таков: микроморфология митохондрий у нексилотрофные грибов не зависит от типа среды; у ксилотрофов на богатой питательной среде (мальт-агаре) несколько усиливается фрагментация митохондрий. Наиболее она выражена у S. hirsutum. В. Анализ динамики сверхдлинных митохондрий с возрастом мицелия показал (на примере S. hirsutum), что наиболее выражены сверхдлинные митохондрии в мицелии 4-7 суток роста. Затем усиливается фрагментация сверхдлинных митохондрий. После 3-х недель роста сигнал от родамина 6Ж может пропадать (видимо, ухудшается проходимость пробы в старые клетки). Г. На вопрос, являются ли сверхдлинные митохондрии межклеточными, мы пока дали отрицательный ответ. На Рис.8 из приложенного файла видно, что сверхдлинные митохондрии, достигая септы, либо «обрываются», либо «заворачивают». Однако мы не исключаем, что в некоторых клетках возможны межклеточные переходы митохондрий через поры, но пока не получили подтверждения. 3. Для понимания функций грибных митохондрий важно оценить степень их поляризации, или иными словами качественно или количественно определить разницу протонного потенциала на внутренней мембране митохондрий. Мы сделали это, сравнив флюоресцентные сигналы родамина 6Ж и НАО, а также отследив динамику изменения мощности сигнала при использовании протонного разобщителя. Мы использовали современный разобщитель дыхания BAM15 (Kenwood et al., 2014), при концентрации 10 мкМ он вызывает в клетках животных полную деполяризацию и максимальную скорость дыхания. Считается, что до 50 мкМ он не оказывает цитотоксического действия на животную клетку. 10 мкМ BAM15 вызывает быструю и полную потерю сигнала от сверхдлинных митохондрий S. hirsutum, 200 нМ приводит к постепенному затуханию сигнала. На НАО-сигнал BAM15 либо не влияет (200 нМ), либо (10 мкМ) немного ускоряет его затухание (у всех проб есть естественное время затухания - примерно через 20 мин после обработки сигнал от НАО пропадает в любом случае, 10 мкМ BAM15 сокращает это время до 15 мин). У C. comatus палочковидные митохондрии гаснут только при концентрации BAM15 30мкМ, нитевидные затухают быстро при значительно меньших концентрациях. Полученные результаты указывают на то, что по степени поляризованности митохондрии S. hirsutum и C. comatus можно разложить в следующий ряд по убыванию потенциала: короткие палочковидные митохондрии C. comatus - сверхдлинные митохондрии S. hirsutum - нитевидные митохондрии C. comatus. Выраженная поляризованность первых двух групп митохондрий в ряду следует из того, что их метит самая низкая концентрация родамина 6Ж, и микроморфология сигнала практически идентична НАО-сигналу. То, что палочковидные митохондрии C. comatus поляризованы сильнее, чем сверхдлинные митохондрии S. hirsutum, можно предположить на основании разной чувствительности к ВАМ15. Слабая поляризованность нитевидных митохондрий C. comatus следует из того, что они отлично метятся НАО, но требуют для мечения высоких концентраций родамина 6Ж. 4. Первая задача, связанная с ультраструктурным анализом грибных клеток - дополнительное подтверждение существования сверхдлинных митохондрий. Однако оказалось, что при использовании наших рутинных методик подготовки ТЭМ-препаратов можно сохранить в достаточно интактном виде только фрагментированные митохондрии. Сверхдлинные митохондрии у ксилотрофных грибов (на примере S. hirsutum) в элктронно-микроскопических препаратах не сохраняются. Причем в пользу именно нарушения целостности говорит наличие так называемых митохондриальных трэков - явных следов в ультратонком срезе через грибную клетку, оставшихся от протяженных митохондрий, потерявших обе мембраны (Рис. 9 из приложенного файла). Такой результат указывает на то, что мембраны сверхдлинных митохондрий могут отличаться от мембран фрагментированных митохондрий по составу и прочим параметрам. Мы изменили методику фиксации материала для ТЭМ, сделав акцент на сохранности мембран, и получили положительный результат. Нам удалось « поймать» ультратонкий срез через сверхдлинные митохондрии, причем на Рис. 10 в приложенном файле запечатлен очень удачный ракурс - одновременно молодая и более зрелая клетки. Видно, что в молодой клетке сверхдлинная митохондрия имеет внутреннее содержимое и кристы. В более зрелой клетке митохондрия теряет содержимое и кристы и превращается в длинную полую двумембранную трубку. Таким образом, обобщая результаты, описанные в пп. 1-4, мы можем заключить: 1). Подбор митохондриальных проб, дающих качественный результат, работающих в наномолярных концентрациях и в четко определяющемся режиме без гашения, для грибов возможен. Мы разработали тест-систему, состоящую из двух разных митохондриальных проб и разобщителя BAM15, позволяющую всесторонне изучать митохондриом мицелиальных базидиомицетов. 2). У грибов, относящихся к разным эколого-трофическим группам, совершенно разные типы митохондриомов, что, безусловно, связано с их различающейся функциональной нагрузкой и, в конечном счете, является приспособлением к их эколого-трофическим условиям жизни. Так, например, у C. comatus митохондриом состоит из присутствующих в одних и тех же гифах двух субпопуляций митохондрий. Короткие палочковидные митохондрии сильно поляризованы и отвечают за дыхание, нитевидные митохондрии имеют слабый потенциал и, скорее всего, либо являются запасным пулом для коротких митохондрий (замещают их по мере повреждения последних), либо выполняют другие не дыхательные функции (синтез аминокислот, трикарбоновых кислот и т.д.). 3). Сверхдлинные митохондрии ксилотрофных базидиомицетов также являются приспособлением к эколого-трофическим условиям существования данных грибов. Сложность древесины как субстрата обусловлена как наличием лигно-целлюлозного комплекса в стенках клеток древесины, так и крайне низким содержанием азота (Watkinson et al., 2006). Для освоения такого сложного субстрата у ксилотрофов должен быть набор «мощных инструментов», помогающий им искать и оккупировать древесину. Мы предполагаем, что сверхдлинные митохондрии изменяют свои функции во время своего созревания. Первоначально такие митохондрии выполняют дыхательную функцию, будучи достаточно поляризованными и имея кристы, одновременно, система сверхдлинных митохондрий может ускорять распространение в гифе энергетических и метаболических ресурсов. Затем, при созревании клеток, сверхдлинные митохондрии теряют кристы и превращаются в двумембранные трубки, отвечающие за быстрый транспорт ресурсов вдоль гиф (Рис. 11 в приложенном файле). Однако мы подтвердили данную гипотезу только ТЭМ-методом, во флюоресцентных препаратах мы не обнаружили сверхдлинных митохондрий, не несущих сигнала от родамина 6Ж, но несущих от НАО. Возможно, зрелые митохондрии-трубки теряют способность связываться с НАО. Существует еще одна гипотеза, объясняющая существование сверхдлинных митохондрий. Ранее для клеток животных предполагали, что крупный митохондриальный ретикулум может выполнять роль своеобразной защиты от митофагии (Rambold et al., 2011). Поскольку у ксилотрофных грибов, особенно во время поиска субстрата, в клетках высокий уровень автофагии, нельзя исключать, что увеличение длины митохондрий также может защищать митохондриом от «самопереваривания». 5. Подготовлена к печати экспериментальная статья «Ксилотрофные базидиомицеты: псевдопоисковый рост, особенный эндоцитоз и сверхдлинные митохондрии», которую мы планируем отправить в редакцию журнала Fungal Ecology (импакт-фактор - 3,7). В настоящее время (декабрь 2018 года) статья находится на стадии перевода на английский язык. Работа охватывает несколько вопросов экологии и питания ксилотрофных базидиомицетов, но особое внимание в ней уделено сверхдлинным митохондриям, как приспособлению ксилотрофов к освоению древесного субстрата Список литературы: Hickey PC, Swift SR, Roca MG, & Read ND (2004). Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Methods in microbiology 34: 63-87. Kenwood BM, Weaver JL, Bajwa A, Poon IK, Byrne FL, Murrow B.A, Okabe K (2014). Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular metabolism 3: 114-123. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, Brown EB, & Gelbard HA (2011). Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques 50: 98-115. Rambold AS, Kostelecky B, Elia N, & Lippincott-Schwartz J (2011). Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proceedings of the National Academy of Sciences 108: 10190-10195. Watkinson S, Bebber D, Darrah P, et al. (2006). The role of wood decay fungi in the carbon and nitrogen dynamics of the forest floor. In: Fungi in Biogeochemical Cycles (Gadd GM, ed.). Cambridge University Press, GB: 151-181. Weber RW, Wakley GE, & Pitt D (1998). Histochemical and ultrastructural characterization of fungal mitochondria. Mycologist 12: 174-179.
2 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. Сверхдлинные митохондрии ксилотрофных грибов: структура и функции
Результаты этапа: Разработана трехкомпонентная система флюоресцентного мечения митохондрий грибов. В ее состав входят митохондриальные пробы родамин 6Ж, нонилакридин оранжевый и разобщитель BAM15. Данная система мечения превосходит по эффективности, качеству и информативности обычные методы работы с грибными митохондриями. На флюоресцентном уровне подтверждено существование сверхдлинных митохондрий у ксилотрофов, изучены их морфология, поляризованность и динамика формирования. Кроме того, показано, что не только ксилотрофные грибы обладают экстраординарной митохондриальной системой. У базидиомицетов из других экологических групп также есть уникальные особенности митохондриомов, являющихся, видимо, приспособлением к конкретным эколого-трофическим условиям. На ультраструктурном уровне существование сверхдлинных митохондрий также подтверждено. Кроме того, по данным ТЭМ сверхдлинные митохондрии с возрастом клетки не сразу фрагментируются, а, теряя кристы, трансформируются в двумембранные трубки-каналы. Последний результат является значимым подтверждением гипотезы о том, что сверхдлинные митохондрии у ксилотрофов, наряду с другими тубулярными системами клетки, участвуют в дальнем транспорте ресурсов. Дальний транспорт особенно важен для ксилотрофов, поскольку они живут в условиях дефицита азота в древесине, либо в режиме экономии питательных веществ при поиске древесного субстрата. Результаты Проекта освещают ранее неизвестные свойства важнейшей органеллы эукариот – митохондрии; и могут иметь прикладной выход в виде разработок фунгицидов новых поколений.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".