ИСТИНА

Был разработан новый метод препаративного выделения хромоцентров (конститутивного гетерохроматина) из интерфазных ядрах печени мыши. Используя этот метод, можно фракционировать хромоцентры в зависимости от их размера. Фракции хромоцентров характеризуют более простым составом белков и содержанием некоторых негистоновых белков по сравнению с ядрами и ядрышками. В фракции хромоцентров обнаружена активность теломеразы. Было найдено, что процессивность теломеразной активности в хромоцентрах была ниже, чем у теломеразы, не включенной в структуру хромоцентров. По дот-гибридизации было показано наличие сателлитных ДНК (MiSat и Masat) в хромоцентрах. С помощью дот-гибридизации с синтетическим фрагментом теломерной ДНК было обнаружена теломерная ДНК (telDNA) в составе ДНК изолированной фракции хромоцентров. Методами иммуногистохимии и иммуноблоттинга в хромоцентрах выявлено наличие специфического компонента кинетохор - белка CHENP А, а также белков, связанные с MiSat и Masat (P70 и P120), которые одновременно являются белками ядерного матрикса. Отсутствие обогащения chromocentre фракции telDNA, MiSat и CHENP А и также цитологические эксперименты показывают, что эти компоненты хромосомы находятся, по-видимому, на периферии хромоцентров. Было установлено, что ДНК хромоцентров имеет большое количество повторяющихся GC-богатых последовательностей, являющихся GC-богатыми сателлитами. Разработан также метод фракционирования ядер на хромоцентры, связанные с ядерной оболочкой, ядрышек, фрагментов ядерной оболочки не связанных с хромоцентрами и растворимого хроматина. Это дает возможность определять биохимическими методами локализацию telDNA и активность теломеразы в интерфазных ядрах. Выделены также фракции хромоцентров из печени коровы, описан состав их белков, получены поликлональные антитела к белкам хромоцентров. Выполнено также выделение остаточного матрикса хромоцентров после экстракции их 2М NaCl и проведён предварительный анализ состава белков в остаточных структур хромоцентров.

1. Разработан метод выделения фракции хромоцентров из ядер печени мыши и дана общая характеристика ее белкового состава. Метод позволяет разделять хромоцентры по размерам. Сравнительный анализ белков полученных фракций хромоцентров, ядер и ядрышек показал, что фракция хромоцентров отличается от ядер и ядрышек повышенным содержанием негистоновых белков с молекулярными массами около 51, 63, 73 и 180 кДа. Во фракции хромоцентров методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга показано присутствие специфического белка кинетохоров – CENP A, что говорит о прочном взаимодействии компонентов кинетохоров с хромоцентрами в интерфазе. Иммуноцитохимическим методом двойной окраски сывороткой к белку CENP A и флуорохромом DAPI на хромоцентры было показано, что сигнал от окраски сывороткой занимает только часть хромоцентров и, в основном, находится на поверхности хромоцентров. Используя метод тройного окрашивания ядер (антитела к белку В23 ядрышек, антитела к белку CENP A кинетохоров и DAPI на хромоцентры) было выявлено, что в тех случаях, когда хромоцентры контактируют с ядрышком, окрашивание сывороткой на CENP A происходит на границе между ядрышком и хромоцентром. Таким образом, компоненты кинетохоров, по-видимому, находятся на поверхности хромоцентров и могут принимать участие во взаимодействии хромоцентров с другими структурами ядра. 2. С помощью дот-гибридизации ДНК различных ядерных фракций с радиактивно меченным зондом теломерной ДНК было обнаружено, что ДНК из всех выделенных препаратов хромоцентров гибридизуется с мечеными зондами теломерного повтора. Таким образом, можно заключить, что во фракции хромоцентров присутствуют теломерные концы хромосом. Однако фракции хромоцентров не обогащены теломерными последовательностями ДНК. Степень гибридизации зонда с тотальной ДНК ядра и ДНК диффузного хроматина выше, чем с ДНК хромоцентров. Поскольку центромерный район акроцентрических хромосом мыши сближен с теломерой короткого плеча, пониженное содержание теломерных последовательностей ДНК в хромоцентрах можно связать с более короткой длиной теломерной ДНК на проксимальной теломере по сравнению с дистальной (Slijepcevic, 1998). Мы предполагаем также, что теломерный хроматин расположен на периферии хромоцентров и может частично обрезаться в процессе выделения хромоцентров. 3. Методом амплификации теломерных повторов (TRAP) (Kim and Wu,1997) было определено, что в выделенной фракции хромоцентров присутствует теломеразная активность. Используя раствор глицерина с градиентом концентрации и физиологической ионной силой, удалось разделить разные формы теломеразы: растворимую и связанную. Фракция хромоцентров содержит только прочно связанную теломеразу, не отделяемую от хромоцентров в физиологическом солевом растворе глицеринового градиента. В тоже время, в других фракциях хроматина, не связанных с хромоцентрами наблюдается растворимая или ассоциированная с мелкими фрагментами хроматина теломераза. Оказалось, что эти две фракции отличаются по процессивности. Теломераза, связанная с хромоцентрами, имеет процессивность ниже, чем теломераза, не связанная с хромоцентрами. Теломераза хромоцентров добавляет к праймеру не более 10 теломерных повторов. Поскольку показано, что проксимальная (по отношению к центромере) теломера в среднем в 2-3 раза короче и однороднее по длине дистальной теломеры (Slijepcevic, 1998), эти результаты позволяют выдвинуть гипотезу о том, что эффект действия центромеры на длину проксимальной теломеры обусловлен снижением процессивности теломеразного комплекса, функционирующего на проксимальной теломере. Поскольку не было обнаружено увеличения удельной активности теломеразы во фракциях хромоцентров, выделение теломеразного комплекса из фракции хромоцентров было признано нецелесообразным. Также, в связи с тем, что теломеразная активность хорошо определяется в исследуемых ядерных фракциях и без активации пролиферации, выделение хромоцентров из регенерирующей печени решено было временно отложить. 4. В процессе дальнейших исследований было обнаружено, что часть хромоцентров разворачивалась на первом этапе выделения, при гомогенизации печени, и хроматин хромоцентров мог переходить во фракцию растворимого хроматина. Более того, большинство хромоцентров теряло изначальную связь с ядерной оболочкой, видимо, из-за разворачивания (диспергирования) хроматина по периферии хромоцентров, в том числе, со стороны ядерной оболочки. Это могло приводить к потере части белков и ДНК, находящихся на периферии хромоцентров, в том числе белков CENP A и теломерной ДНК. Действительно, мы не наблюдали существенного обогащения этими компонентами фракции хромоцентров. Было найдено, что увеличение концентрации ионов магния в растворе для гомогенизации печени до 6-10 мМ значительно увеличивает количество хромоцентров в выделенных ядрах. При этом основная часть хромоцентров прочно сидит на ядерной оболочке, что хорошо видно при световой микроскопии препаратов. Это обстоятельство дало возможность на первых этапах выделения отделять диффузный хроматин от комплекса хромоцентров с ядерными оболочками без использования ультразвуковой обработки. Для расщепления диффузного хроматина использовалась значительно более мягкая обработка эндогенной нуклеазой (которая и так происходила при выделении ядер в присутствии ионов магния) или с добавлением ДНКазы I в низкой концентрации. Это дает возможность не загрязнять фракцию диффузного хроматина хроматином хромоцентров и хроматином, связанным с ядерной оболочкой, которые по нашим данным содержат теломерную ДНК. Затем фракция хромоцентров, связанных с оболочкой, мягко обрабатывалась ультразвуком для отделения хромоцентров от фрагментов ядерной оболочки с дальнейшим разделением полученных компонентов дифференциальным центрифугированием и в ступенчатом градиенте сахарозы (30-40-50-60%). В результате модификации количественный выход препаратов хромоцентров увеличился в 1,5 – 2 раза. Количество ДНК в выделяемых препаратах хромоцентров теперь составляет до 8% от тотальной ядерной ДНК. 5. Локализация теломерной ДНК в интерфазных ядрах высших эукариот до конца не выяснена, а исследования локализации теломеразы только начинаются (Yang et.al., 2002; Etheridge et.al., 2002). Поэтому была поставлена задача: разработать метод фракционирования ядра на фракции, содержащие и не содержащие теломеры, а также попробовать разделить в разные фракции ядра дистальные теломеры, находящиеся на длинном плече хромосом мыши, и проксимальные теломеры короткого плеча, предположительно находящихся в связи с хромоцентрами. По цитологическим данным известно, что примерно половина теломерных концов хромосом располагается в ядре вне хромоцентров (Cerda et.al., 1999). Показано также, что теломеры часто расположены на периферии ядра в связи с ядерной оболочкой (Dernburg et.al., 1995; Podgornaya et.al.,2000). Наши предварительные данные, полученные методом дот-гибридизации с теломерной ДНК, показали наличие высокой концентрации теломерной ДНК во фракции, прочно связанной с ядерной оболочкой. Благодаря модификации метода выделения хромоцентров нам удалось разработать методику выделения хромоцентров в комплексе с ядерной оболочкой, отделившись от хроматина не связанного с этими структурами. Были выделены также отдельные фракции хромоцентров, ядерных оболочек (Прусов и др., 1989) и ядрышек с целью биохимического изучения локализации теломерных повторов ДНК в разных фракциях ядра. Препараты ДНК были выделены из этих фракций и подготовлены для дот-гибридизации с меченным зондом теломерной ДНК. 6. Для определения длины теломерной ДНК в хромоцентрах, включающих в свой состав предположительно проксимальные теломеры, и фракциях диффузного хроматина и ядерных оболочек, предположительно содержащих дистальные теломеры, необходимо было выделить эти фракции с сохранением полимерности теломерной ДНК. Чтобы сохранить полимерность ДНК к растворам для выделения ядер добавляли N-этилмалеимид (NEM), ингибирующий эндогенную нуклеазу. Первоначально для фрагментации хроматина предполагалось применить рестриктазы, не расщепляющие теломерную ДНК. Однако использованные рестриктазы PstI и Sfr274 I (Xho I) не работают или очень слабо работают на конденсированном в присутствии ионов Mg2+ хроматине. Поэтому применили метод последовательной обработки ультразвуком. В конденсированном состоянии хроматин разрезается ультразвуком на большие блоки, не уменьшая полимерности ДНК внутри этих блоков. Поскольку хроматин с полимерной ДНК имеет повышенную устойчивость к механической фрагментации, ядра обрабатывались ультразвуком короткое время (15 секунд), не разрушенные ядра осаждались и вновь подвергались короткому воздействию ультразвука. Действуя таким образом, удалось фрагментировать ядерный хроматин до уровня, используемого в методике, отработанной нами для выделения хромоцентров и других ядерных фракций. Пульс-электрофорез ДНК полученных фракций показал, что уровень полимерности ДНК достигает 50-150 kbas. Препараты ДНК из этих фракций были выделены и обработаны двумя рестриктазами PstI и Sfr274 I (Xho I). Продукты рестриктазной обработки разделялись электрофорезом и были подготовлены для блот-гибридизации с меченным зондом теломерной ДНК. 7. По последним литературным данным, показанным с помощью цитологических методов, каталитическая субъединица теломеразы (hTERT) (наряду с теломеразной РНК - hTR) обнаружена в ядрышке, по-видимому, для сборки полноценного фермента (Yang et.al., 2002; Etheridge et.al., 2002). Неизвестно, работает ли теломераза в ядрышке или является только предшественником активного фермента. Поскольку, одной из задач данной работы является поиск ядерных фракций с высокой теломеразной активностью, мы решили исследовать теломеразную активность в изолированных ядрышках, а также в других фракциях ядра, полученных с помощью модифицированного метода выделения хромоцентров (см. выше). Ядрышки получали обработкой ядер ультразвуком (первая стадия в методе выделения хромоцентров) и освобождали от примеси хроматина обработкой раствором 20 мМ триэтаноламина pH 7,6 и 0,1 мМ MgCl2 (в котором конденсированный хроматин хромоцентров разворачивается до диффузного состояния) и очисткой в сахарозном градиенте. В настоящее время в выделенных фракциях исследуется теломеразная активность с помощью метода амплификации теломерных повторов (TRAP) (Kim and Wu,1997). Планируется также сравнительное исследование теломеразной активности в этих фракциях из клеток печени мыши в норме (находящихся на стадии G0) и после активации пролиферации в регенерирующей печени. По материалам изучения локализации теломерной ДНК, определения её длины и теломеразной активности в исследуемых ядерных фракциях будет подготовлена статья для опубликования в международном журнале. 8. Известно, что в состав интерфазных хромоцентров входят центромерный и, возможно, околоцентромерные участки хроматина. Точная локализация различных центромерных и околоцентромерных доменов пока не исследовалась. Известно, что в центромерном участке метафазной хромосомы локализована минорная сателлитная ДНК (МинСат), а непосредственно к центромере примыкает крупный околоцентромерный домен, содержащий мажорную сателлитную ДНК (МажСат) (Лобов и Подгорная, 1999). Чтобы исследовать содержание этих последовательностей сателлитной ДНК в интерфазных хромоцентрах, из фракций выделенных хромоцентров была получена ДНК для гибридизации её с зондами МинСат и МажСат. Работа проводилась совместно с лабораторией института цитологии РАН (зав. лаб. Подгорная О.И.). Результаты дот-гибридизации показали, что зонды МинСат и МажСат гибридизуются с ДНК хромоцентров. Однако степень гибридизации с МажСат намного сильнее, чем с МинСат. При гибридизации in situ на мышиных клетках культуры ткани было обнаружено, что МажСат выявляется непосредственно в области хромоцентров, а зонд на МинСат часто локализуется по периферии хромоцентров. Таким образом, вероятно, что в основе хромоцентров мыши находится околоцентромерный блок хроматина, содержащий МажСат, а МинСат центромеры расположен на периферии. Поэтому в изолированных хромоцентрах МинСат может частично терятся в процессе выделения. Полученные результаты будут использованы для подготовки совместной публикации. 9. Совместно с лабораторией Подгорной О.И. института цитологии РАН начато комплексное исследование ДНК выделенных фракций хромоцентров путем клонирования последовательностей ДНК хромоцентров с последующим их сиквенсом. В настоящее время проводится сиквенс около 20 клонов. Оказалось, что большинство клонированных последовательностей обогащены ГЦ-парами оснований, в отличие от АТ-богатых МинСат и МажСат. На рис. 1 \fig{pic1.rtf} представлены четыре секвенированные последовательности ДНК хромоцентров. Получено 5 штук клонов с последовательностью под номером hrc13. Из чего можно сделать вывод, что данная последовательность представлена в хромоцентрах в больших количествах. При гибридизации in situ с этими последовательностями показано, что исследуемые зонды ДНК локализуются в интерфазных ядрах в хромоцентрах или по их переферии. А на метафазных пластинках в центромерных и прицентромерных областях. По результатам этой работы будет подготовлена публикация. 10. В нашей совместной работе с лабораторией Подгорной О.И. было исследовано содержание белка 70 кД, связывающегося с минорной сателлитной ДНК (Енукашвили, Подгорная, 2001), и белка 120 кД, связывающегося с мажорным сателлитом ДНК мыши (Lobov et.al., 2000), в изолированных фракциях хромоцентров с помощью иммуноблоттинга.. Антитела на эти белки дали положительную окраску соответствующих белков во фракции хромоцентров. Окраска на белки р70 и р120 кД косвенно свидетельствует о присутствии во фракции хромоцентров и минорного сателлита, расположенного в первичной перетяжке митотической хромосомы (Joseph et.al.,1989), и околоцентромерных областей хромосомы, содержащих мажорную сателлитную ДНК, что подтверждает полученные нами данные по гибридизации с зондами на МинСат и МажСат (см. выше). Поскольку оба белка входят в состав ядерного матрикса, а белок 120 кд (SAF A) является кроме того структурным белком скэффолда митотических хромосом (Лобов, Подгорная, 1999), наши наблюдения говорят о том, что в составе выделенных хромоцентров присутствуют также элементы хромосомного скэффолда или ядерного матрикса. Было обнаружено также наличие р70 и р120 в ядрышковой фракции, что может отражать известное взаимодействие части хромоцентров и ядрышка, либо самостоятельное присутствие этих белков в ядрышке. 11. В настоящее время отсутствуют данные о структурной основе конденсированного состояния хромоцентров. Известно, что хроматин хромоцентров имеет особую упаковку, проявляющуюся в наибольшей электронной плотности на ультратонких срезах и большей устойчивостью к разворачивающему воздействию растворов с низкой ионной силой. Природа этой устойчивости неизвестна. Предполагается, что определенные белки, участвующие в структурной организации конститутивного хроматина, могут определять этот эффект. Кандидатами на эти белки могут быть белки, входящие в состав ядерного матрикса или скэффолда хромосом. Поэтому получение “скелетной” структуры (скэффолда или матрикса) важно для изучения структуры хромоцентров. Мы предприняли попытку получить скелетную основу хромоцентров по модификации известной методики (Berezney and Coffey, 1977). Для формирования сети скелетной структуры использовали обработку хромоцентров раствором, содержащим 1мМ тетратионата натрия, с последующей экстракцией раствором 2М NaCl. Получены предварительные данные по белковому составу остаточной структуры хромоцентров. Обработка хромоцентров раствором 2М NaCl приводит к экстракции прежде всего гистоновых белков. Однако в матриксе (скэффолде) сохраняется остаточное количество гистонов, причем гистоны Н3 и Н4 присутствуют в большем количестве, чем другие гистоны. Негистоновые белки экстрагируются в разной степени. Хорошо экстрагируются белки с молекулярной массой выше 75 кДа, в частности, мажорный белок около 105 кДа. Белки более низкой молекулярной массы экстрагируются, в основном, частично. При этом по сравнению с составом исходных хромоцентров в составе матрикса (скэффолда) увеличивается интенсивность и относительная доля белковых зон около 21,25, 27, 32, 40, 47, 50-55 к Да. Сохраняется также значительная доля белков в области 60-73 кДа. Какой-либо выделяющейся белковой зоны, специфичной для остаточной структуры, выявлено не было. Эти результаты свидетельствуют о том, что остаточная («скелетная») структура хромоцентров, полученная этим методом, может быть сложена многими белками, входящими в состав хромоцентров. 12. Фракцию хромоцентров из печени мыши попытались использовать для получения моноклональных антител на белки хромоцентров. Работа проводилась совместно с лабораторией клеточной инженерии НИИ вирусологии (руководитель – д.б.н. Кущ А.А.). Однако после многократной иммунизации мышей фракцией хромоцентров, выделенных из мышиных ядер, не было получено хорошего иммунного ответа. Поэтому была поставлена задача: разработать метод выделения фракции хромоцентров из ядер печени коровы. Хромосомы коровы, как и хромосомы мыши, акроцентрические и интерфазные ядра содержат хромоцентры, сходные по структуре с хромосомами мыши. Для получения хромоцентров из печени коровы была использована разработанная методика выделения хромоцентров из печени мышей. Фракции хромоцентров из ядер печени коровы были успешно выделены. Получено несколько фракций, отличающихся размером хромоцентров (от 200 до 600 нм), а также фракции ядрышек и диффузного хроматина. Фракции ядер, диффузного хроматина, хромоцентров и ядрышек использовались для электрофоретического разделения белков, входящих в их состав. Эти фракции имеют количественные различия в содержании отдельных белков. Во фракции диффузного хроматина основную долю занимают низкомолекулярные гистоновые белки. По сравнению с ядрами она обогащена также белком в районе 40 кДа и обеднена белками с молекулярной массой больше 45 кДа. В хромоцентрах значительную долю занимают белки средней молекулярной массы от 43 до75 кДа, особенно в зонах около 43, 47, 61 и 65 кДа. Эти зоны по молекулярной массе очень сходны с зонами преобладающих белков в хромоцентрах мыши. В хромоцентрах коровы представлены в значительном количестве также зона около 90 кДа и несколько зон в районе 150-250 кДа. Большинство этих зон есть также во фракции ядрышек. Однако во фракции ядрышек присутствует много других зон негистоновых белков, в частности, около 22, 25, 36, 40, 57 и 96 кДа, при этом доля гистоновых белков снижена. Выделенные фракции хромоцентров коровы были использованы для иммунизации мышей с последующим получением моноклональных антител в лаборатории клеточной инженерии НИИ вирусологии. 13. В результате длительной иммунизации мышей хромоцентрами, выделенными из печени коровы были получены поликлональные сыворотки от двух мышей. Иммуноцитохимическое исследование показало, что сыворотки дают точечное окрашивание в интерфазном ядре, причем часть точек располагается в области хромоцентров. Исследование иммуноблоттингом показало, что обе сыворотки дают окрашивание нескольких белковых зон, часть из которых окрашена более ярко. Одна сыворотка наиболее ярко окрашивает зоны в области 64-67 и 58 кДа. Другая окрашивает более широкий спектр белковых зон, в том числе дает окрашивание с гистонами. В белках хромоцентров ярко окрашивается полоса около 36 кДа и в районах 58, 65 и 75 кДа. Слабые полосы видны около 46 и примерно в районе 120 кДа. Среди ядерных белков сыворотка окрашивает большее количество зон, в том числе очень яркие зоны в районе 120 и 150 кДа. Чуть слабее окрашены зоны около 58 и 65, 115 и 130 кДа. В настоящее время иммунизированные мыши используются для получения моноклональных антител.