ИСТИНА

Проект направлен на изучение механизмов фотоактивности оранжевого каротиноидного белка (ОКБ, Orange Carotenoid Protein – OCP). Данный пигмент-белковый комплекс является сенсором и эффектором нефотохимического тушения у цианобактерий и, благодаря своей структурной организации, является удобным модельным объектом для изучения каротиноидов, фотоактивных белков и разработки новых биологических триггерных систем. Актуальность данного направления подтверждается работами, недавно опубликованными в Scientific Reports, PNAS, Science и других высокорейтинговых журналах. Несмотря на достижения последних лет, нативная структура красной – активной формы ОСР не установлена из-за проблем получения стабильных монокристаллов белка, элементы структуры которого обладает большой подвижностью. В связи с этим, получение структурных данных и экспериментальное установление последовательности фотохимических превращений в ОСР представляется возможным только при использовании альтернативных рентгеновской кристаллографии структурных методов - ядерного магнитного резонанса (ЯМР, Nuclear Magnetic Resonance - NMR), малоуглового рентгеновского рассеяния и рассеяния нейтронов (Small Angle X-ray Scattering (SAXS), Small Angle Neutron Scattering (SANS)) в растворе. Для реализации этих задач в рамках данного проекта предусмотрено использование полученного нами штамма Escherichia coli, продуцирующего белок OCP из цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 и обеспечивающего метаболическое превращение бета-каротина в эхиненон, являющийся хромофором ОСР. Необходимость использования специализированного штамма E. coli продиктована также возможностью получения ряда мутантных форм белка для установления роли определенных аминокислот в акте фотопревращения, а также получения отдельных структурных доменов ОСР. Получение белка, меченого стабильными изотопами 13C и 15N, в комплексе с хромофором позволит провести отнесение сигналов 1H, 13C и 15N в спектрах ЯМР и определить набор спектральных параметров, необходимых для расчета структуры ОСР в растворе. Для изучения фотоциклических превращений ОСР и его мутантных форм будет использован набор спектральных методов: спектрофлуориметрия с высоким (до пс и фс) временным разрешением, корреляционная спектроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния, что позволит произвести сопоставление между структурными данными и спектральными характеристиками белка. С помощью комбинации SAXS и SANS, а также набора дополнительных методов (например, картирования участков взаимодействия по данным химического «сшивания» с последующей масс-спектрометрической идентификацией «сшитых» пептидов – crosslinking mass-spectrometry) будут впервые получены структурные данные о взаимодействии ОСР с недавно (2010 г.) обнаруженным белком, регулирующим восстановление флуоресценции фикобилисом – Fluorescence Recovery Protein (далее – FRP). Запланированные исследования позволят не только изучить фундаментальные механизмы регуляции нефотохимического тушения флуоресценции у цианобактерий, но также получить информацию о динамике конформационных изменений в фотоактивном белке, а также понять принципы белок-белковых и белок-хромофорных взаимодействий, определяющие уникальные спектральные характеристики данного комплекса. Результаты исследования могут быть использованы для разработки новых белковых сенсорных систем (триггеров) для современных методов исследований биологических систем (в том числе оптогенетики).

The project aims to study the mechanisms of photoactivity of orange carotenoid protein (OCP). This pigment-protein complex is a sensor and effector of non-photochemical quenching in cyanobacteria and, because of its structural organization, it is a convenient model for the study of carotenoids, photoactive proteins and for development of new biological trigger systems. The relevance of this trend is confirmed by works, recently published in Scientific Reports, PNAS, Science and other top-rated journals. In spite of the achievements of recent years, the native structure of the red active form of the OCP is unknown, mostly due to inability to obtain stable crystals of the protein for the X-ray, as structural elements of OCP are characterized by high mobility. In this context, obtaining of structural data and experimental sequencing of photochemical transformations in the OCP is possible only with the use of alternative structural methods - nuclear magnetic resonance (NMR, Nuclear Magnetic Resonance - NMR), small-angle X-ray scattering and neutron scattering (Small Angle X -ray Scattering (SAXS), Small Angle Neutron Scattering (SANS)) in solution. To achieve these objectives within the framework of this project we foresee the use of strain of Escherichia coli, obtained by us, that produces OCP from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and providing a metabolic conversion of beta-carotene in echinenone acting like a chromophore of OCP. The necessity of using specialized E. coli strain is also dictated by the possibility to obtain a number of mutant forms of the protein to determine the role of specific amino acids in the act of photoconversion and produce individual structural domains of OCP, which are convenient for initial stages of NMR experiments. Preparation of holoprotein labeled with stable 13C and 15N isotopes will allow us to assign signals from 1H, 13C and 15N in NMR spectra and to determine a set of spectral parameters to calculate OCP structure in solution. To study photocyclic transformations of OCP and its mutant forms the set of spectral methods will be used: spectrofluorimetry of high (up to ps and fs) time resolution, correlation spectroscopy, Raman spectroscopy, which will allow us to make a comparison between the structural data and the spectral characteristics of the protein. Using a combination of SAXS and the SANS, and a set of additional methods (eg, method of mapping the sites of interaction according to the chemical "crosslinking" with subsequent mass spectrometric identification of "linked" peptides - crosslinking mass-spectrometry) will be first obtained the structural data on the interaction of the OCP to the recently (in 2010) discovered protein that regulates the fluorescence recovery of phycobilisomes - Fluorescence Recovery Protein (hereinafter - FRP). The planned research will not only allow to study the fundamental mechanisms of regulation of non-photochemical quenching of fluorescence in cyanobacteria, but also to obtain information about the dynamics of conformational changes in photoactive protein, as well as to understand the principles of protein-protein and protein-chromophore interactions that determine the unique spectral characteristics of the complex. The results can be used to develop new protein sensor systems (triggers) for modern methods of biological systems research (including optogenetics).

На данный момент, механизм фотопревращения стабильной оранжевой формы ОСР в активную красную изучен недостаточно подробно и остается объектом научных дискуссий. Так, благодаря кристаллографии, известна структура оранжевой формы белка, однако, кристаллы красной формы до сих пор не удается получить, вероятно, из-за неупорядоченности элементов третичной структуры этой формы. Существует множество независимых доказательств неупорядоченности красной формы (в том числе полученные нами (Maksimov et al. 2015 Biophysical Journal), которые свидетельствуют о том, что красная форма ОСР является расплавленной глобулой. Тем не менее, результаты кристаллографии так называемого красного каротиноидного белка (RCP, который представляет собой отдельный N-концевой домен, связанный с кофактором, и может быть получен из ОСР путем удаления С-домена и части последовательности с N-конца) были опубликованы в 2015 году в Science (Leverenz, R.L., Sutter, M., Wilson A., Gupta, S., Thurotte, A., Bourcier de Carbon, C., Petzold, C.J., Ralston, C., Perreau, F., Kirilovsky, D., Kerfeld, C.A. (2015). A 12 Å carotenoid translocation in a photoswitch associated with cyanobacterial photoprotection. Science 348 (6242): 1463-1466.). Авторы этой статьи обнаружили, что в белке RCP каротиноид перемещается относительно своего положения в ОСР примерно на 1.2 нм вглубь N-домена, и утверждают, что такие же изменения, вероятно, происходят в ходе фотоиндуцированого превращения оранжевой формы ОСР в красную. Однако данное изменение положения каротиноида может быть вызвано гидрофобными взаимодействиями, т.е. нарушением локального окружения каротиноида в результате удаления С-домена апопротеина. Очевидно, такое сопоставление положений хромофора в комплексах с исходно отличающимися апопротеинами не совсем корректно, а предложенный механизм фотоизомеризации, по всей видимости, далек от процессов, происходящих в нативном белке. Более того, в последние месяцы нами были получены стабильные препараты С-домена ОСР, содержащие каротиноид, т.о., сам факт наличия каротиноида в том или ином домене не является доказательством того, что при фотоконверсии происходит перемещение каротиноида в пределах одного домена. Предлагаемый нами подход основан на сопоставлении структур нативного белка в растворе и не требует кристаллизации белка. Активная форма может быть получена с помощью фотоконверсии, а также, как показали наши недавние исследования, в результате замены одного из функционально значимых триптофанов, стабилизирующего белок-каротиноидный контакт в оранжевой форме ОСР, на аланин (Sluchanko, N. N., Klementiev, K. E., Shirshin, E.A., Tsoraev, G. V., Friedrich T. and Maksimov, E. G (2016). "The purple Trp288Ala mutant of Synechocystis OCP persistently quenches phycobilisome fluorescence and tightly interacts with FRP." Biochim Biophys Acta 1858(1): 1-11), полученный препарат обладает всеми признаками красной формы и способен тушить флуоресценцию фикобилисом in vitro. Для получения структурной информации планируется применение методов многомерной гетероядерной спектроскопии ЯМР. Данный метод успешно применялся ранее для изучения структурных изменений желтого фотоактивного белка PYP (результаты исследования опубликованы в Nature Structural Biology – Rubinstenn, G., Vuister, G. W., Mulder, F. A., Düx, P. E., Boelens, R., Hellingwerf, K. J., & Kaptein, R. (1998). Structural and dynamic changes of photoactive yellow protein during its photocycle in solution. Nature Structural & Molecular Biology 5(7), 568-570). Методы ЯМР также высоко информативны при исследовании молекулярных движений белковой цепи в широкой шкале времени (от пс до часов) с разрешением до отдельных атомов, что представляется особенно важным при исследовании активной сигнальной формы ОСР, учитывая ее высокую динамичность, но низкую термодинамическую стабильность и упорядоченность. Тем не менее, применение методов ЯМР накладывает особые требования на подготовку исследуемых образцов. Требуется, в частности, получение образцов белка, обогащённого стабильными изотопами 15N и 13C от уровня их естественного содержания (~0.37% и ~1% соответственно) до ~100%. Ввиду значительного размера исследуемого объекта (35 кДа) может также потребоваться частичное или полное дейтерирование белка. Облегчить задачу может частичное удаление концевых разупорядоченных последовательностей и введение отщепляемого полигистидинового тага для облегчения очистки меченого рекомбинантного белка. Нами был выполнен перенос гена, кодирующего ОСР, из Synechocystis в E. coli и в настоящее время данная конструкция успешно используется для создания мутантных форм ОСР (как с точечными заменами аминокислот, так и со значительными изменениями первичной структуры белка). Это достижение позволило нам приступить к исследованию ОСР с использованием широкого спектра методов, в результате в 2016 году нами было подготовлено 5 статей (на момент подачи заявки 2 статьи опубликованы и 3 отправлены в журналы). Также, с помощью измерения синхротронного SAXS, непосредственно совмещенного с хроматографическим разделением (SEC) исследуемых частиц (методология SEC-SAXS), получены предварительные данные о структуре активной формы ОСР и её комплекса с FRP низкого разрешения, однако ситуация осложняется тем, что белок ОСР проявляет некоторую склонность к самоассоциации, мешающей анализу его комплексов с FRP. В дальнейшем, в рамках предлагаемого проекта мы планируем получить более детальную информацию о структуре регуляторного комплекса OCP/FRP в растворе и механизме участия белка FRP в отмене фотопротекторного действия ОСР. В частности, при разделении ОСР на отдельные субструктуры и домены, мы предполагаем получить первые прямые результаты о том, с каким участком белка ОСР взаимодействует FRP. Стоит отметить, что данный вопрос совершенно не изучен, и часть опубликованных исследований предполагает взаимодействие FRP c N-концевым доменом ОСР, однако в других работах предполагается обратное – что взаимодействие происходит между FRP и C-концевым доменом ОСР. Таким образом, расшифровка структуры красной формы является логическим продолжением наших исследований. В рамках данного проекта, культура клеток E. coli будет выращена в средах, содержащих изотопы 2H, 15N и 13C, для получения образцов ОСР с соответствующим уровнем изотопного замещения. Это необходимо для обеспечения возможности измерения многомерных гетероядерных спектров ЯМР, отнесения сигналов 1H, 13C и 15N белка и дальнейшего установления структуры активной красной формы ОСР и изучения динамических свойств белковой цепи. Практически уникальная комбинация методов молекулярной биологии, биохимии, структурной биологии и наиболее современных спектральных методов исследований позволит нам детально изучить фотоцикл ОСР и установить связь между изменениями конформации хромофора и белковой глобулы. В результате реализации проекта будут получены структурные и кинетические экспериментальные данные, необходимые для выявления механизма фотопревращения ОСР и активации нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом цианобактерий, регулируемого фотоактивным белком ОСР, а также для определения сайта взаимодействия ОСР и фикобилисомы.

Нами был впервые получен и охарактеризован мутант ОСР с заменой триптофана-288 на аланин. Данный мутант обладает интенсивной пурпурной окраской (Maksimov, E. G., et al. (2016). "A comparative study of three signaling forms of the orange carotenoid protein." Photosynthesis Research 130(1-3): 389-401), по величине гидродинамического радиуса и функциональной активности соответствует красной активной форме ОСР (Sluchanko, N. N., et al. (2016). "The purple Trp288Ala mutant of Synechocystis OCP persistently quenches phycobilisome fluorescence and tightly interacts with FRP." Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics 1858(1): 1-11). Таким образом, мутант W288A является удобным и перспективным модельным объектом для изучения активной формы ОСР, поскольку этот препарат является достаточно термостабильным и не требует предварительной активации. Данный препарат будет изучен с помощью методов ЯМР спектроскопии и SAXS. Для проверки гипотезы о перемещении каротиноида между доменами ОСР нами был проведен эксперимент, в котором мы провели селективное мечение цистеинов флуоресцентным красителем тетраметилродамином. В результате был получен комплекс, флуоресценция которого обратимо изменяется в ответ на фотоконверсию ОСР. Исследование спектрально-временных характеристик данного комплекса позволило нам, используя теорию Ферстера, оценить изменение расстояния между флуоресцентным красителем и хромофором ОСР при переходе из оранжевой формы в красную. Наши результаты подтверждают гипотезу о том, что каротиноид покидает С-домен (статья проходит рецензию в Biophysical Journal). Также данная конструкция позволяет изучать взаимодействие и образование комплексов с ядрами фикобилисом или FRP с помощью ряда удобных и доступных методов флуоресцентной спектроскопии. Нами было показано, что скорость конверсии комплекса ОСР-TMR зависит от температуры и вязкости среды, что позволяет рассматривать данную систему как сенсор этих важных экспериментальных параметров.

Проект будет способствовать решению фундаментальной проблемы – установлению общих механизмов и закономерностей функционирования фотоактивных белков для создания новых биосенсорных систем и предсказания их свойств. Ввиду научной ценности структурных данных о красной форме белка мы предполагаем, что результаты исследования будут опубликованы в высокорейтинговых журналах. Практический интерес изучения данной системы заключается в следующем: 1. Возможность контроля спектральных свойств белка позволяет рассматривать его как триггерную систему, подходящую для управления различными биологическими процессами. В литературе уже отмечалась перспективность ОСР как материала для оптогенетических исследований (Kirilovsky, D. and C. A. Kerfeld (2013). "The Orange Carotenoid Protein: a blue-green light photoactive protein." Photochem Photobiol Sci 12(7): 1135-1143.). Мы предполагаем, что ОСР и его структурные производные также могут быть использованы в качестве контраста для оптоакустической томографии. 2. ОСР является высокоэффективным тушителем активных форм кислорода (Sedoud, A., et al. (2014). "The Cyanobacterial Photoactive Orange Carotenoid Protein Is an Excellent Singlet Oxygen Quencher." The Plant Cell 26(4): 1781-1791.). Ввиду того, что каротиноид находится в белковом окружении и за счет этого водорастворим, системы на основе ОСР можно рассматривать как перспективные антиоксиданты, которые в будущем могут стать частью модульных систем с адресной доставкой. 3. Установленная нами зависимость скорости фотоконверсии ОСР от температуры может быть использована для определения локальной температуры в гибридных и/или клеточных системах. 4. Выявление закономерностей влияния локального окружения хромофора на скорость фотоконверсии может быть использовано для создания сенсора вязкости.