Аннотация:Система репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR) исправляет «ошибки», возникающие при репликации ДНК. Ключевыми белками системы репарации являются MutS и MutL. Комплексы этих белков с ДНК являются конформационно подвижными, что затрудняет их изучение. Нами предложена методология изучения формирования тройного комплекса MutS-MutL-ДНК, в основе которой лежат два метода – ковалентной фиксации белка на ДНК и Фёрстеровского переноса энергии (FRET). В гомогенном состоянии получены конъюгаты, в которых мутантные формы MutS(N497C) и MutS(A336C) присоединены к ДНК через линкеры различной длины. В комплексе с MutS(N497C) ДНК зафиксирована вблизи «мисматч»-связывающего центра белка, в комплексе с MutS(A336C) – в полости, формирующейся при изменении конформации белка на «скользящий зажим». Методом FRET изучена кинетика образования комплекса MutL с мутантными формами MutS в составе конъюгатов с ДНК. Донором флуоресценции выступал краситель Sytox Blue, имеющий высокое сродство к двутяжевой ДНК. Акцептор – Alexa-594 – присоединяли к введенному в позицию 297 остатку Cys белка MutL. Показано, что скорость образования тройного комплекса MutL-MutS-ДНК и выход зависят от места «сшивки» MutS с ДНК, от длины линкера между белком и ДНК и от концентрации АТФ. Скорость образования комплекса MutL с MutS в 1,5–3 раза выше в присутствии 1 мМ АТФ по сравнению с 10 мкМ АТФ, что связано со скоростью перехода белка MutS в активную форму «скользящий зажим». MutL в 2 раза более эффективно связывается с конъюгатом MutS(N497C)-ДНК, чем с MutS(A336C)-ДНК, причем выход комплекса MutL-MutS(N497C)-ДНК не зависит от длины линкера, на котором закреплён MutS. Белок MutL не взаимодействует с MutS(A336C), зафиксированным на ДНК с помощью короткого линкера. Таким образом, комплекс MutS(N497C)- ДНК является предпочтительным для «привлечения» MutL и дальнейшей активации всей системы MMR. Очевидно, что ДНК после связывания MutS молекулы АТФ сближается с позицией 336 в белке, но при формировании тройного комплекса с меняет свое положение относительно MutS. Предложенный нами подход позволяет фиксировать конформационные перестройки, происходящие в процессе формирования лабильных комплексов с участием нескольких белков и ДНК.
