Новый способ диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера с использованием фибробластов кожи пациента. Российский общенациональный офтальмологический форумтезисы доклада

Работа с тезисами доклада


[1] Новый способ диагностики наследственной оптической нейропатии Лебера с использованием фибробластов кожи пациента. Российский общенациональный офтальмологический форум / Т. А. Невиницына, Н. Л. Шеремет, Т. Д. Крылова и др. // Российский общенациональный офтальмологический форум. — Т. 1 из 9. — Москва: Москва, 2016. — С. 219–222. Актуальность. Наследственная оптическая нейропатия Лебера (НОНЛ) – генетическое заболевание, в основе патогенеза которого лежит дисфункция митохондрий. Клиническая картина характери-зуется резким двусторонним безболезненным снижением зрения, развивающимся, как правило, у лиц молодого и среднего возраста. При подозрении на наследственный характер потери зрения пациент направляется на генетический анализ для выявления мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), ассоциированных с НОНЛ. В настоящее время известно 14 первичных и около 20 кандидатных мутаций [1]. Однако генетический дефект удается обнаружить не во всех случаях. В таких ситуациях исследование функциональной активности клеток пациента (лейкоцитов, фибробластов, гибридных клеток с генотипом пациента) может оказать существенную помощь в постановке диагноза. Определение этиологии снижения зрительных функций важно не только для офтальмологического, но терапевтического и неврологического прогноза, так как НОНЛ может сопровождаться неврологической и системной патологией. Правильно поставленный диагноз способствует назначению патогенетического лечения и корректных рекомендаций по образу жизни, позволяет проводить медико-генетическое консультирование родственников пациента. Мутации мтДНК, являющиеся причиной НОНЛ, приводят к дисфункции митохондрий, в первую очередь нарушая процесс передачи электронов по дыхательной цепи митохондрий (ДЦМ) и снижая количество вырабатываемых молекул АТФ, параллельно растет продукция активных форм кислорода, падает митохондриальный потенциал. В результате этих изменений происходит апоптоз ганглиозных клеток сетчатки и последующая атрофия зрительного нерва. Комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) – самый крупный компонент ДЦМ, он участвует в передаче электронов от НАДН к убихинону (коэнзим Q) и в поддержании мембранного потенциала митохондрий. У больных с НОНЛ был доказан дефект I комплекса ДЦМ [2]. Паракват (N,N'-диметил-4,4'-дипиридилия дихлорида) – гербицид, широко применяемый в научных исследованиях для индукции окислительного стресса в клеточных культурах. Ранее было показано, что для проявления цитотоксичности параквата критичным является его восстановление в митохондриях за счет активности комплекса I, после чего он приобретает способность взаимодействовать с кислородом с образованием высокоактивного супероксида [3, 4]. При дисфункции I комплекса ДЦМ у пациентов с НОНЛ восстановление параквата до его радикальной формы должно происходить в гораздо меньших объемах, что проявится в более высокой устойчивости клеток пациентов к токсическому действию параквата по сравнению с клетками здорового контроля. Цель: разработать способ детекции активности I комплекса ДЦМ для подтверждения наследственного характера оптической нейропатии с использованием цитотоксического действия параквата на клеточной культуре фибробластов кожи. Результаты. При анализе полученных данных выявлено различие в окрашивании клеток здоровых людей и клеток пациентов с НОНЛ, которое отражает разницу в количестве живых фибробластов в клеточной культуре. Фибробласты пациентов с мутациями m.3460G>A (N=2), m.11778G>A (N=2), m.4171C>A (N=1), а также пациента с клинической картиной НОНЛ и его сестры с заменой m.3472T>C (на данный момент не входит в список причинных мутаций при НОНЛ) оказались значительно более устойчивы к действию параквата, что указывает на снижение функции I комплекса ДЦМ. У пациента с мутацией m.14484T>C (n=1) в состоянии гетероплазмии (когда в клетке присутствуют и нормальные, и мутантные мтДНК) показатели чувствительности к токсическому действию параквата имели промежуточные значения между теми, что демонстрировали контрольные культуры и культуры от пациентов с НОНЛ. Заключение. Предложен новый способ детекции нарушения работы I комплекса ДЦМ, подтверждающий митохондриальную дисфункцию изучаемых клеточных культур (фибробластов кожи) пациентов с НОНЛ и позволяющий проводить быстрый скрининг большого количества различных клеточных линий (Заявка на выдачу патента РФ на изобретение: 14.04.2016, № 2016114491). Количество живых фибробластов, определяемое по флуоресцентному сигналу резазурина после цитотоксического действия параквата, в клеточных культурах пациентов с клиническим диагнозом НОНЛ достоверно выше по сравнению со здоровыми людьми. Литература 1. http://www.mitomap.org/bin/view.pl/MITOMAP/MutationsLHON 2. Baracca A., Solaini G., Sgarbi G. et al. Severe impairment of complex i– driven adenosine triphosphate synthesis in Leber hereditary optic neuropathy cybrids // Arch. Neurol. – 2005. – Vol. 62, No. 5. – P. 730. 3. Fukushima T., Yamada K., Isobe A. et al. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. I. NADH oxidation and paraquat radical formation via complex // I. Exp. Toxicol. Pathol. – 1993. – Vol. 45, No. 5-6. – P. 345-349. 4. Cochemé H.M., Murphy M.P. Complex I is the major site of mitochondrial superoxide production by paraquat // J. Biol. Chem. – 2008 . – Vol. 283, No. 4 . – P. 1786-1798.

Публикация в формате сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл сохранить в файл скрыть