|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
ПОЛУЧЕНИЕ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ В ПОСТГЕНОМНУЮ ЭПОХУстатья
- Авторы: Тишков В.И., Пометун А.А., Атрошенко Д.Л., Паршин П.Д., Савин С.С.
- Журнал: Актуальная биотехнология
- Том: 1
- Номер: 35
- Год издания: 2021
- Первая страница: 279
- Последняя страница: 279
- Аннотация: Ферменты – это высокоэффективные природные катализаторы. Благодаря высокой регио- и стереоселективности они очень широко применяются в тонком органическом синтезе и фармацевтической промышленности. Однако высокая селективность часто является «слабым» местом, поскольку в ходе эволюции ферменты были оптимизированы по природные молекулы и поэтому они могут быть малоэффективными с синтетическими аналогами, которые часто и используются в качестве лекарственных препаратов. Другими важными факторами, ограничивающими применение биокатализа на практике, являются высокая стоимость получения, невысокая температурная и операционная стабильность, несовпадение оптимальных условий проведения процесса с оптимальными условиями функционирования самого фермента. Развитие методов рекомбинантных ДНК и белковой инженерии позволило снизить себестоимость получения и повысить стабильность, однако применение этих методов для изменения каталитических свойств и особенно селективности оказалось очень трудозатратным и часто не давало требуемого результата.Появление методов высокоэффективного секвенирования позволило определить последовательности геномов тысяч организмов, особенно бактерий и архей. Современные секвенаторы за один цикл работы (несколько дней) позволяют секвенировать десятки геномов микроорганизмов. Развитие методов биоинформационного анализа и компьютерного моделирования дает возможность предсказания каталитических свойств и селективности ферментов. Основываясь на результатах биоинформационного анализа можно выбрать источник, в геноме которого имеется ген фермента со свойствами, которые наиболее близки к желаемым. В результате такого подхода (genome mining) были клонированы тысячи генов разных ферментов. В данном докладе будут представлены наши собственные данные по использованию данного подхода. В результате были получены новые формиатдегидрогеназы (FDH) и оксидазы D-аминокислот (DAAO) с повышенной каталитической эффективность и стабильностью. В случае DAAO были клонированы ферменты нового типа, которые ранее не были описаны.Несмотря на очень высокую каталитическую эффективность, ферменты имеют свои для этих параметров предельные значения. Поэтому нельзя постоянно улучшать свойства отдельного биокатализатора. Если в процессе используется не один а два (или более) фермента, катализирующих сопряженные реакции эффективность биокатализа может быть повышена за счет получения гибридных молекул, в которых в одной полипептидной цепи находятся последовательности обоих ферментов (слитые белки, fusion enzymes). В этом случае путь молекул (продукта первой реакции и одновременно субстрата второй) от одного активного центра до другого резко сокращается. Нами с использованием данного подхода были получены два типа таких гибридных биокатализатора на основе в качестве первого фермента цитохрома Р450 ВМ3 или фенилацетонмонооксигеназы (РАМО), а вторым ферментом была формиатдегидрогеназа, которая обеспечивала регенерацию восстановленного NADPH, необходимого для осуществления первой реакции. Было проведено компьютерное моделирование структур таких гибридных белков с разной последовательностью расположения ферментов (например, Р450ВМ3-FDH и наоборот). Были получены генно-инженерные конструкции, позволяющие экспрессировать эти гибридные ферменты в активной форме, получены варианты с разным полилинкером. Гибридные биокатализаторы были получены в очищенном виде и были изучены их каталитические свойства. Было показано, что такие гибриды в зависимости от типа субстрата обеспечивают ускорение процесса от 2 до 10 раз.
- Добавил в систему: Алексеева Анастасия Александровна