|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Система для изучения взаимодействия белка ядерного экспорта NEP вируса гриппа А с матриксным белком М1 in vitroтезисы доклада
- Авторы: Головко А.О., Королева О.Н., Друца В.Л.
- Сборник: ХХ Всероссийская конференция молодых ученых-химиков (с международным участием)
- Тезисы
- Год издания: 2017
- Место издания: Изд-во ННГУ им. Н.И. Лобачевского Нижний Новгород
- Первая страница: 81
- Последняя страница: 81
- Аннотация: Вирус гриппа А относится к числу вирусов, репликация генома которых происходит в ядрах инфицированных клеток. Согласно современным представлениям, перенос вирусного РНП из ядра в цитоплазму происходит с участием белка ядерного экспорта NEP (14 кДа) и матриксного белка М1 (28 кДа). Предполагается существование прямых межмолекулярных контактов за счет М-домена белка М1 и С-концевого домена белка NEP, хотя убедительные доказательства взаимодействия указанных белков отсутствуют. В настоящей работе с целью изучения комплексообразования белков М1 и NEP была разработана система, предполагающая получение в чистом виде целевых белков путем их экспрессии в бактериальных клетках с последующей аффинной хроматографией. Препарат белка ядерного экспорта с His(6)-модулем на С-конце (NEP-С-His(6)) был получен по описанной ранее методике с использованием хроматографии на Ni-агарозе. Для получения белка М1 в настоящей работе была сконструирована плазмида, позволяющая экспрессировать M1 в виде «слитого» белка (M1-Int-CBD-His(6)), содержащего на С-конце модули для двойной аффинной хроматографии: Int-CBD (интеин и хитин-связывающий домен) и His(6). После аффинной хроматографии последовательно на Ni-агарозе и хитиновом носителе и удаления модулей (интеин-катализируемый сплайсинг) белок М1 был получен в чистом виде и без дополнительных белковых довесков. Стратегия, выбранная для получения комплексов белков М1 и NEP, предполагает использование аффинных носителей в двух вариантах: 1) белок NEP-C-His(6) иммобилизовали на колонке с Ni-агарозой и затем пропускали через колонку раствор белка М1; 2) белок M1-Int-CBD-His(6) иммобилизовали на колонке с хитин-содержащим носителем и затем пропускали через колонку раствор белка NEP-С-His(6). После промывания колонок от избытка пропускаемого белка носители обрабатывали реагентами для отщепления иммобилизованного белкового материала (0,3 М имидазол в первом случае и 0,1 М дитиотреитол – во втором). Первые данные свидетельствуют о перспективности такого подхода, однако проведение экспериментов осложняется склонностью обоих белков к агрегации, что на данном этапе требует оптимизации разрабатываемой методики. Pабота выполнена пpи финанcовой поддержке Pоccийcкого фонда фундаментальныx иccледований (гpант № 15-32-20629).
- Добавил в систему: Nuwanda