Аннотация:Белок ядерного экспорта NEP вируса гриппа А участвует в одном из важнейших про-
цессов жизненного цикла вируса - экспорте вирусного генома из ядра в цитоплазму. Ранее
нами было показано, что рекомбинантный белок склонен к образованию агрегатов. Це-
лью настоящей работы было изучение этого явления методом химического кросслинкинга
- подхода, широко используемого для исследования структуры белковых комплексов.
Препараты NEP, содержащие на N- или С-конце His(6)-модуль (NEP-N и NEP-C), полу-
чали в результате продукции белков в специально созданной бактериальной экспрессион-
ной системе с последующей аффинной хроматографией на Ni-NTA-агарозе. Для изучения
агрегации проводили эксперименты по «сшивке» (кросслинкингу) присутствующих в рас-
творе белковых агрегатов глутаровым альдегидом - бифункциональным реагентом, взаи-
модействующим с ����-аминогруппами остатков лизина. При проведении реакции варьирова-
ли следующие параметры: концентрацию глутарового альдегида (0,001 М - 0,2 М), рН рас-
твора, время инкубации (8-30 мин), присутствие низкомолекулярных добавок (соли арги-
нина, SDS и другие). Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 10-15%
SDS-ПААГ. Полученные данные свидетельствуют о наличии в растворе димерных и более
высокомолекулярных продуктов сшивки (составляющих до 70% от массы всего белка), что
подтверждает высокую склонность белка к агрегации. В присутствии 100 мМ аргинина
(дезагрегирующий агент) доля олигомеров существенно уменьшается, а добавление 1%
SDS полностью предотвращает образование агрегатов. Ранее в работе [1] с использова-
нием другого бифункционального реагента этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцината)
[EGS] было показано, что только делеционный вариант белка NEP, лишенный N-концево-
го домена (но не полноразмерный белок), способен к образованию димера.
Таким образом, в настоящей работе впервые методом кросслинкинга с использованием
глутарового альдегида было продемонстрировано наличие высокомолекулярных агрегатов
растворах белка NEP при физиологических условиях.
Pабота выполнена пpи финанcовой поддержке Pоccийcкого фонда фундаментальныx
иccледований (гpанты №№ 15-32-20629 и 13-04-01504).
Источники и литература
1) Akarsu H., Burmeister W.P., Petosa C. Crystal structure of the M1 protein-binding
domain of the influenza A virus nuclear export protein (NEP/NS2). // EMBO J. 2003.
N. 22(18). P. 4646–4655.