|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Тhe technology of creation and quality testing of immunofluorescent probes with dye alexa-488 for analysis of celular populations by flow cytometryстатья
Статья опубликована в журнале из списка RSCI Web of Science
Статья опубликована в журнале из перечня ВАКСтатья опубликована в журнале из списка Web of Science и/или Scopus
- Авторы: Kopyrulina M.E., Zakharova E.N., Zabotina T.N., Blokhin D.Yu, Ivanov P.K.
- Журнал: Российский биотерапевтический журнал
- Том: 17
- Номер: 1
- Год издания: 2018
- Издательство: Изд. группа РОНЦ
- Местоположение издательства: М.
- Первая страница: 70
- Последняя страница: 75
- DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-70-75
- Аннотация: Введение. Получение флуоресцентных зондов на основе моноклональных антител (МКА) к поверхностным антигенам лейкоцитов человека является актуальной задачей, решение которой даст возможность проводить научные и клинические исследования в области онкологии, гематологии, иммунологии, эпидемиологии. Цель исследования - создание флуоресцентных зондов на основе МКА и флуоресцентного красителя Alexa-488 для анализа клеточных популяций и субпопуляций лейкоцитов человека методом проточной цитометрии. Материалы и методы. В работе использовали МКА к антигену В-лимфоцитов (клон ИК0-180) и флуоресцентный краситель Alexa-488 в форме активного моносукцинимидного эфира. МКА выделяли из асцитной жидкости мышей с привитой внутрибрюшинно гибридомой путем комбинированной очистки иммуноглобулиновой фракции каприловой кислотой и высаливания сульфатом аммония. Для очистки полученных конъюгатов (иммунофлуоресцентных зондов, ИФЗ) применяли гель-фильтрацию на колонке PD-10, концентрацию и плотность мечения ИФЗ определяли спектрофотометрически. Оценку биологической активности полученных ИФЗ проводили с использованием клеток периферической крови доноров в диапазоне концентраций МКА 0,5-100 мкг/мл. Определение рабочего титра ИФЗ проводили по методу титрования антител, предложенному C.C. Stewart. Результаты. Экспериментально установлено оптимальное время инкубирования МКА с флуорофором. Получена панель ИФЗ с различной плотностью мечения Alexa-488. Для этого варьировали молярное соотношение МКА и флуорофора в среде реакции конъюгирования от 1:2 до 1:100. Оптимальная плотность мечения ИФЗ находится в диапазоне 5-13,5 М:М, концентрация антител - в диапазоне 5-25 мкг/мл. Для ИФЗ из МКА ИКО-180 с Alexa-488 такие высокие значения плотности мечения не приводят к снижению эффективности флуоресценции и антигенсвязывающей способности. Сравнительная характеристика специфической активности ИФЗ на основе МКА ИКО-180 и коммерческих ИФЗ (BD Biosciences) показала сопоставимые результаты. Заключение. Оптимальными условиями для мечения МКА ИКО-180 красителем являются: карбонатный буфер с рН 8,3, концентрация антител в реакционной смеси 1 мг/мл, количество активного красителя 10-100 ммоль на 1 ммоль белка, время инкубирования 90 мин при температуре 18-25 °С.
- Добавил в систему: Заботина Татьяна Николаевна