|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
ВЛИЯНИЕ N-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СОИ GLYCINE MAX НА ЕЁ СВОЙСТВАстатья
- Авторы: Шапошников Л.А., Пометун А.А., Савин С.С., Тишков В.И.
- Журнал: Актуальная биотехнология
- Том: 1
- Год издания: 2022
- Первая страница: 358
- Последняя страница: 358
- Аннотация: NAD(P)±зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2, ФДГ) впервые найдена в растениях, позже в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах. Этот фермент играет важную физиологическую роль в различных организмах, например, в растениях является белком стресса, а в патогенных бактериях синтезируется при их переходе в состояние биоплёнки. ФДГ широко применяется в тонком органическом синтезе вместе с другими оксидредуктазами в виде смесей ферментов, а также «сшитых» в одну полипептидную цепь. Роль ФДГ заключается в регенерации восстановленного кофермента NAD(P)H. Кроме того, ФДГ применяется в биоаналитических целях для определения формиата и NAD+ в различных биологических жидкостях [1]. Для успешного применения на практике необходимо, чтобы фермент обладал высокой каталитической эффективностью, был устойчивым к температурной и химической инактивации, а процесс получения и очистки фермента должен быть простым и быстрым. Наша лаборатория систематически изучает формиатдегидрогеназы из различных организмов уже много лет. Нами накоплен большой опыт по получению генетических конструкций, содержащих гены ФДГ, разработке методик экспрессии и эффективной очистке, а также сайт-направленному мутагенезу. Ранее нами было проведено клонирование ФДГ из сои Glycine max (SоуFDН), поскольку соя – это важная сельскохозяйственная культура, поэтому изучение её механизмов ответа на стрессовые условия является важной задачей. Данный фермент в сое имеет сигнальный пептид на N-конце, однако было показано, что при клонировании наличие сигнального пептида может вызвать появление телец включения. Поэтому данный ген бал получен в двух формах: «длинной», соответствующей полноразмерному гену SоуFDН без сигнального пептида на N-конце, а также «короткой», аналогичной по своей последовательности N-конца гену ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101. Для облегчения и ускорения выделения и очистки ферментов в их ген часто добавляют последовательность, кодирующую шесть остатков гистидина (His-tag, гистаг). Нами были получены две новые конструкции: с добавлением гистага на N-конец «длинной» формы и «короткой» формы. Показано, что наличие гистага снижает уровень экспрессии обеих форм в клетках E.coli, а также, что «длинная» форма имеет больший уровень экспрессии, чем короткая. Помимо этого, были изучены основные свойства полученных ферментов – кинетические параметры и температурная стабильность. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта No 21–34–70046 мол_а_мос
- Добавил в систему: Алексеева Анастасия Александровна