|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗЦИИ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА ПРИ ДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРОВ ФОСФОЛИПАЗЫ С И АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫстатья
- Авторы: НИКОЛАЕВ М.Ю., ТЮРИН-КУЗЬМИН П.А., КУЛЕБЯКИН К.Ю., НАЙДА Д.А., ВОРОНЦОВА М.В.
- Сборник: РЕЦЕПТОРЫ И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ
- Том: 1
- Год издания: 2021
- Место издания: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» Пущино
- Первая страница: 241
- Последняя страница: 244
- Аннотация: Введение. Остеопороз – заболевание костно-мышечной системы, при котором нарушается метаболизм костной ткани, что приводит к повышенной хрупкости костей и риску возникновения переломов. Поиск новых методов лечения данного заболевания в последнее время становится все более актуальным. Увеличение продолжительности жизни приводит к возрастанию числа остеопоротических переломов [1]. Также отмечается связь остеопороза с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний [2]. Одним из важнейших факторов, определяющих связь между костным анаболизмом и катаболизмом, является паратиреоидный гормон. Рецепторы данного гормона – ПТГ1Р и ПТГ2Р – регулируют уровень кальция в крови, ремоделирование и созревание кости. Причем ПТГ1Р, располагаясь на поверхности клеток костей взрослого человека, определяет резорбцию кости в ответ на снижение уровня кальция в кости, чем может усиливать развитие остеопороза. С другой стороны, ПТГ1Р усиливает дифференцировку постнатальных стволовых клеток в остеобласты и индуцирует укрепление кости. Ключевыми сигнальными путями, запускаемыми ПТГ1Р являются: 1) цАМФ-зависимый сигнальный каскад, запускаемый αs субъединицей тримерного G-белка, приводящий к активации аденилатциклазы; считается, что данный путь опосредует костный анаболизм; 2) Са2+ -зависимый сигнальный путь, начинающийся с Gαq/11 субъединицы, активирующий фосфолипазу Сβ; инициирует костный катаболизм [3]. Детальное понимание механизмов переключения между этими двумя сигнальными путями открывает новые перспективы в лечении остеопороза и регенеративной медицине. Обновление и регенерация кости осуществляется за счет дифференцировки в остеобласты постнатальных стволовых клеток костной ткани – мультипотентных стромальных клеток (МСК). МСК могут дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, адипоциты [4]. Анаболический эффект в костной ткани паратгормона обусловлен активацией пролиферации и дифференцировки МСК и подавлением апоптоза остеобластов [5]. У пациентов с остеопорозом наблюдается уменьшение количества и активности собственных проостеогенных МСК в результате старения или сопутствующих заболеваний [6]. Данную проблему пытались решить использованием ПТГ в комплексе с введением МСК. Показана эффективность такой терапии на свиньях, однако использованные концентрации ПТГ в сотни раз превышают нормальные физиологические концентрации гормона в крови [7]. Возможная причина данных неудач заключается в гетерогенности популяции МСК и наличии в популяции МСК клеток, не являющихся остеогенными, и даже препятствующих процессу остеообразования. Функциональная гетерогенность МСК была ранее показана нами на примере гормон-опосредованной кальций-зависимой внутриклеточной сигнализации [8,9]. При этом, что интересно, для МСК характерны кальциевые ответы по принципу «все-или-ничего», осуществляемые благодаря высокой активности кальций-индуцированного выброса кальция [10]. Кроме того, мы ранее показали, что МСК гетерогенны по своим ответам на цАМФ-зависимые гормональные стимулы [11]. В данной работе мы изучали функциональную гетерогенность МСК по ответам на ПТГ. Материалы и методы. Для экспериментов использовались МСК, полученные из подкожной жировой ткани брюшной стенки и подкожной жировой ткани колена, а также МСК, выделенные из надкостницы. Клеточные культуры вели в AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cells Media, содержащей 10% AdvanceSTEM Supplement (HyClone) и 1% раствор антибиотика, при температуре 37°С в инкубаторе с 5% CO2. Пересаживали клетки с помощью растворов Версена и HyQTase (HyClone) при достижении конфлюентности 80%. Функциональная активность рецепторов ПТГ на МСК исследована при помощи детекции изменений внутриклеточного уровня кальция прижизненно на уровне одиночных клеток с использованием кальциевого красителя Fluo-8. ПТГ добавляли либо чистым, либо в смеси с селективными ингибиторами фосфолипазы С (U73122) и аденилатциклазы (SQ22536). Ответы МСК на ПТГ регистрировались на уровне одиночных клеток. За день до эксперимента клетки высаживались на 24-луночный планшет с 30% конфлюентностью. За час эксперимента к клеткам добавляли краситель Fluo-8, а за 15 минут добавляли ингибиторы, которые повторно вносились вместе с ПТГ. Полученные результаты анализировались по разработанной методике с помощью программы Fiji ImageJ: 1. При помощи функции Threshold были идентифицированы зоны с достаточным уровнем флуоресценции (клетки). 2. Далее при помощи функции Analyze Particles производился отбор учитываемых клеток – по размеру (от 50 пикселей) и по форме (Circularity 0-0.85). 3. Подходящие по критериям отбора клетки добавлялись в ROI, для них измеряли интенсивность свечения (Mean gray value). 4. Дальнейшая обработка полученных данных производилась в программе Excel. Проводился анализ характера изменения свечения клеток. Критерием, определяющим наличие кальциевого ответа, было принято увеличение яркости пикселей в пределах ROI на 30%. 5. Для устранения артефактных ответов производилась нормировка яркости отвечающих клеток с помощью деления на среднюю яркость выбранной группы не отвечающих клеток. Результаты. По результатам анализа 130 экспериментов с МСК 22 пациентов были выделены 4 типа кальциевых ответов: осциллирующий, плавный, быстрый ответ сразу после добавления гормона, отложенный ответ (через 30 минут после добавления гормона). Отмечалась гетерогенность ответов МСК в зависимости от локации, из которой были выделены клетки. В МСК, выделенных из жира живота, преобладало плавное повышение уровня внутриклеточного кальция. Количество клеток, отвечающих данным образом, составляло 50% от всех отвечающих клеток. В опытах с добавлением ингибитора фосфолипазы С (U73122) количество плавно отвечающих клеток существенно возрастало и составляло 90%. Ингибитор аденилатциклазы (SQ22536) приводил к противоположному эффекту, понижая количество плавно отвечающих клеток до 7%. В этом случае возрастало количество осциллирующих ответов с 20% в контроле до 60% при добавлении ингибитора. Во всех группах экспериментов, как в контроле, так и в ингибиторном анализе, среднее количество отвечавших клеток среди всех клеток, попадающих в область наблюдения, составляло 30%. МСК, выделенные из жира колена, отвечали преимущественно одиночными пиками сразу после добавления гормона. Доля таких ответов составляла 60%. При использовании ингибитора фосфолипазы С возрастала доля плавных ответов до 95% процентов. У клеток, обработанных ингибитором аденилатциклазы, отмечалось возрастание осциллирующих ответов (50%) по сравнению с плавными (10%), в контроле таких ответов наблюдается 25% и 15% соответственно. Количество одиночных пиков существенно не изменялось и составило 40%. Для клеток, выделенных из жира колена, общее число ответов составляло 20%, с ингибитором фосфолипазы С возрасло до 40%. Для МСК, выделенных из надкостницы, свойственны осциллирующие ответы. В контроле количество таких ответов составляло 65%. Ингибитор фосфолипазы С также приводил к увеличению числа плавных ответов с 4% до 60%. При добавлении ингибитора аденилатциклазы возрастало число осциллирующих ответов до 70%. Таким образом, результаты проделанных опытов подтверждают гетерогенность ответов МСК на паратгормон в зависимости от источника выделения клеток [12]. По итогу ингибиторного анализа можно сделать вывод, что при блокировке одного сигнального пути происходит активация другого. Это подтверждается отсутствием уменьшения количества ответов среди всех наблюдаемых клеток. Различные пути внутриклеточной сигнализации активируемые ПТГ могут быть связаны с остеогенной гетерогенностью МСК. Работа была поддержана грантом Российского научного фонда № 19-75-30007.
- Добавил в систему: Воронцова Мария Владимировна