Инженерия N-концевой последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max

Шапошников, Л.А.; Савин, С.С.; Атрошенко, Д.Л.; Чубарь, Т.А.; Пометун, Е.В.; Тишков, В.И.; Пометун, А.А.

Авторы: Шапошников Л.А., Савин С.С., Атрошенко Д.Л., Чубарь Т.А., Пометун Е.В., Тишков В.И., Пометун А.А.
Журнал: Вестник Московского университета. Серия 2: Химия
Том: 64
Номер: 4
Год издания: 2023
Издательство: Издательский дом МГУ
Местоположение издательства: Москва
Первая страница: 377
Последняя страница: 390
Аннотация: NAD(P)+-зависимая формиатдегидрогеназа (FDH, КФ 1.2.1.2.) катализирует окисление формиат иона при сопряженном восстановлении NAD(P)+ до NAD(P)H. Ранее в нашей лаборатории была получена генетическая конструкция с геном soyfdh2, кодирующим изофермент 2 формиатдегидрогеназы из сои Glycine max (SoyFDH), в котором была удалена нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, отвечающий за транспорт профермента в митохондрии клеток растений (фермент SoyFDH_L). В данный работе был получен второй вариант SoyFDH_S, в котором по сравнению с SoyFDH_L последовательность на N-конце была уменьшена и изменена, чтобы получить начальный участок соответствующий последовательности N-конца в FDH из бактерий Pseudomonas sp.101. Далее на N-конец длинной и укороченной форм SoyFDH была добавлена последовательность из шести остатков гистидина (His-tag). Все четыре варианта SoyFDH были экспрессированы в клетках E.coli BL21(DE3)CodonPlus, проведена очистка этих ферментов и определены их кинетические параметры и исследована термостабильность. Показано, что в случае SoyFDH_L, аналогичной природному варианту фермента, как с His tag, так и без него уровень экспрессии выше в два раза по сравнению с укороченным вариантом. Добавление His-tag на N-конец ферментов снижает уровень экспрессии. Изменение последовательности N-конца, а также введение на N-конец последовательности His-tag не оказывает значительного влияния на термостабильность при температурах 50-56 оС, однако за счет более высоких значений энтальпии активации процесса термоинактивации укороченная форма при нормальных температурах стабильнее природной в 3 раза. Сравнение кинетических параметров двух вариантов SoyFDH показывает, что каталитические константы одинаковы, но длинный вариант SoyFDH_L имеет более низкие значения KMHCOO–, а короткий – более низкие величины KMNAD+. Введение His-tag на N-конец ферментов не оказывает влияния на их кинетические параметры.
Добавил в систему: Чубарь Татьяна Анатольевна

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИСТИНА ИНХС РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИСТИНА ИНХС РАН

Инженерия N-концевой последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine maxстатья

Прикрепленные файлы