Аннотация:Флуоресцеин и родамин относят к группе ксантеновых, а Cy5 – к семейству цианиновых красителей. Флуоресцентные свойства данных соединений хорошо изучены, а их производные с различными нуклеотидами коммерчески доступны. Однако знания об электрохимической активности флуоресцеина, родамина и Cy5 довольно скудны, особенно в составе коньюгатов с биомолекулами и биополимерами. Целью работы было исследовать флуоресцеин, родамин и Cy5 в качестве меток для прямого электрохимического обнаружения ДНК, образующейся в результате реакции амплификации, когда происходит полимеразное включение дезоксинуклеозидтрифосфатов, конъюгированных с электроактивными фрагментами, во вновь синтезируемую цепь ДНК [1].Нами были исследованы электрохимические свойства флуоресцеина, родамина и Cy5 алкина, а также 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов, модифицированных остатками флуоресцеина (dUTP-Fl), родамина (dUTP-Rh) или Cy5 (dUTP-Cy5), с помощью циклической и квадратно-волновой вольтамперометрии (КВВАМ) на печатных графитовых электродах. Полученные в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА) меченые ампликоны двунитевой ДНК были определены методом КВВАМ. Флуоресцентные свойства модифицированных нуклеотидов были использованы для выявления взаимосвязи между общим выходом реакции амплификации, количеством меток, включенных в один ампликон, и молярным соотношением модифицированного нуклеотида к нативному в реакционной смеси.На квадратно-волновых вольтамперограммах 0.1 мМ родамин давал четкие пики окисления и восстановления при потенциале (Eп) около 0.8 В и –0.95 В с токами (Iп) примерно 2.5 мкА и –40 мкА соответственно. Для 0.1 мМ dUTP-Rh наблюдали пик окисления при Eп = 0.9 В с Iп = 3 мкА и пик восстановления при Eп = –0.95 В с Iп = –30 мкА. Катодные и анодные пики родамина и dUTP-Rh зависели от концентрации анализируемого вещества. Аналогично родамину, 0.1 мМ флуоресцеин также продемонстрировал четкие пики окисления и восстановления. Флуоресцеин окислялся в два этапа при Eп около 0.6 В и 0.8 В и восстанавливался при Eп = –1 В. Окисление dUTP-Fl также протекало в две последовательные стадии, давая пики при потенциалах около 0.6–0.7 В и 0.8–0.9 В. Первые четко выраженные сигналы окисления флуоресцеина и dUTP-Fl при Eп = 0.6 В дали Iп = 2 мкА и Iп = 1 мкА соответственно. dUTP-Fl продемонстрировал слабый сигнал восстановления при Eп = –1 В. В отличие от родамина и dUTP-Rh, концентрационная зависимость была выявлена только для сигналов окисления флуоресцеина и dUTP-Fl; сигналы их восстановления не зависели от концентрации анализируемого вещества.На вольтамперограммах Cy5 алкин дал ярко выраженные анодные и катодные пики. Сy5 алкин окислялся в две стадии при Eп = 0.55 В и Eп = 0.7 В с Iп для первого пика около 2 мкА и восстанавливался при Eп = –0.9 В с Iп = –50 мкА (концентрация 0.1 мМ). Для 0.1 мМ dUTP-Cy5 наблюдали пики окисления при Eп = 0.55 В и Eп = 1 В с Iп = 2 мкА для первого пика и пик восстановления при Eп = –0.9 В с Iп = –45 мкА. Зависимость Iп Cy5 алкина и dUTP-Cy5 от концентрации анализируемого вещества была получена только для их сигналов окисления. Таким образом, конъюгация меток с dUTP не оказала существенного влияния на электрохимические свойства флуоресцеина, родамина и Cy5.Среди исследуемых производных 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, dUTP-Fl продемонстрировал лучшую совместимость с ПЦР и РПА. Было установлено, что оптимальная доля модифицированных нуклеотидов в ПЦР-смеси составляет 70 % при частичной замене dTTP в реакционной смеси, тогда как для dUTP-Rh эта доля равнялась 20 %, а для dUTP-Cy5 – 50 %. Меченые двунитевые ампликоны всех типов, полученные с помощью ПЦР, были успешно обнаружены КВВАМ в микромолярных и суб-микромолярных концентрациях, использую сигналы окисления соотвествующих меток. В тоже время, в тех же экспериментальных условиях пиков окисления для немодифицированных ампликонов зарегистрировано не было. Следует отметить, что достигнутые аналитические характеристики обнаружения модифицированных ДНК ампликонов соответствуют количеству продукта, образующегося в конечной точке амплификации РПА, что делает разработанный способ пригодным для прямого электрохимического обнаружения ДНК по месту требования. Таким образом, нуклеотиды, модифицированные флуоресцеином, родамином, или Cy5 показали себя многообещающими электроактивными метками для прямого электрохимического обнаружения нуклеиновых кислот. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 19-14-00247, https://rscf.ru/project/19-14-00247/.Литература1. Hocek, M.; Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection // Chem. Soc. Rev. 2011. vol. 40, p. 5802–5814.
