Аннотация:Актуальность. Возрастает необходимость перехода от устаревшей методологии трансплантоло-
гии – использования донорских органов человеческого и животного происхождения – к идеологии
использования биоискусственных органов и тканей.
Цель: разработка панели гибридных белков (ГБ) на основе рекомбинантных спидроинов (РС),
содержащих биологически активные пептиды (БАП), для целей тканевой инженерии.
Материалы и методы. Полноразмерные РС rS1/9 и rS2/12 выделяли из водонерастворимой
фракции клеток штаммов продуцентов S. cerevisiae и очищали с помощью ионно обменной хро-
матографии. ГБ, содержащие разные БАП, были сконструированы по одной схеме: H6 SUMO
1F1 G(SGG)4S (БАП), где H6 – his tag для очистки на Ni колонке; SUMO (Small Ubiquitin Like
Modifier) – пептид – продукт гена Smt3 дрожжей, способствующий повышению выхода в клетках
E. coli; 1F1 – мономер РС rS1/9, выполняющий роль «якоря» при взаимодействии с полноразмер-
ными РС; G(SGG)4S – нейтральный линкер, способствующий экспозиции БАП над поверхностью
матрикса; БАП – любой из клонированных БАП. В качестве БАП использованы: пептид RGDS
(связывается с клеточными интегринами); гепарин связывающий пептид (HBP) (связывает раз-
личные ростовые факторы и взаимодействует с синдеканами); пептид GRGGL (взаимодействует
с нейральными молекулами клеточной адгезии NCAM); Lam – С концевой фрагмент α 5 лами-
нина человека. Гены ГБ были синтезированы химически и клонированы в клетках E. coli. Все ГБ
выделяли из клеток штаммов продуцентов и очищали с помощью металл хелатной аффинной
хроматографии на Ni колонке. Растворы РС и ГБ смешивали в определенных соотношениях и ими
покрывали поверхность полистирольных планшетов (2D матриксы) с последующей инкубацией в
этаноле. Исследовали влияние различных БАП на адгезию и пролиферацию первичных мышиных
дермальных фибробластов и эмбриональных фибробластов 3Т3, а также на дифференцировку ней-
робластомы человека SH SY5Y и на рост клеток нейральных предшественников из человеческих
индуцированных плюрипотентных клеток и их дифференцировку в нейроны.
Результаты. На фибробластах отмечено увеличение в сравнении с контролем количества только
РНК коллагена I, а количество РНК αSMA и TGF β были снижены на всех покрытиях, особенно
на rS1/9+ГБ(Lam), где также выявлялось максимальное снижение количества РНК фибронектина и
коллагена III – компонентов так называемого временного межклеточного матрикса. Это означает,
что все покрытия не обладают профибротическим действием, то есть не будут вызывать образова-
ние рубца при регенерации кожных травм. Подложка, состоящая из смеси полноразмерных РС и
ГБ(RGDS), наиболее эффективно поддерживала направленную нейрональную дифференцировку
клеток нейробластомы человека SH SY5Y. Также продемонстрировано влияние различных БАП
на дифференцировку нейрональных клеток через активацию экспрессии генов, вовлеченных в
норме в дифференцировку, что соответствует известной роли этих пептидов в процессах тканевой
регенерации.
Заключение. Впервые разработана генно инженерными методами панель слитых белков, содер-
жащих фрагмент рекомбинантнтого спидроина и биологически активные пептиды, клонированные
из природных белков межклеточного матрикса, которые в человеческом организме участвуют
в регуляции многих процессов регенерации тканей. В экспериментах продемонстрировано, что
определенные сочетания биологически активных пептидов вызывают активацию определенного
типа клеток, что позволяет обеспечивать специфическую регенерацию соответствующих тканей